تشخيص مقاومت به افلوكساسين با روش مولكولي سريع Allele Specific PCR ‏در مايكوباكتريوم توبركلوزيس

Allele Specific-PCR method for rapid detection of gyrA gene mutaions in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis

مقدمه: مقاومت به فلوروكينولون‏ها در بيماري سل رو به گسترش است. ‏تشخيص مقاومت به روش كشت خلط دو ماه به طول مي‏انجامد. ‏مطالعه حاضر، به منظور طراحي روشي براي تشخيص سريع مقاومت سويه‏هاي كلينيكي مايكوباكتريوم توبركلوزيس به افلوكساسين انجام شد. مواد و روش‏‏ها: در اين مطالعه، ‏DNA‏هاي استخراج شده از 41 سويه كلينيكي مايكوباكتريوم توبركلوزيس ‏حساس و مقاوم ‏به افلوكساسين موجود در بانك DNA مركز تحقيقات سل و بيماري‏هاي عفوني با دو روش مولكولي آلل اسپسيفيك پي سي آر (AS-PCR) و تعيين ترادف (سكوينس)، براي تعيين موتاسيون در منطقه مرتبط با مقاومت ژن gyrA با هم مقايسه شدند. ‏پرايمرهاي داخلي براي تشخيص موتاسيون‏هاي مرتبط با مقاومت طراحي و شرايط ‏PCR ‏تعيين شد‏. ‏قطعه مورد نظر درتعدادي از نمونه‏ها تعيين ترادف شده و به‏عنوان استاندارد طلايي با روش‏هاي ارايه شده مقايسه شد. نتايج: روش AS-PCR ‏به خوبي قادر به تشخيص موتاسيون با تشكيل يا عدم تشكيل باند داخلي شد‏ كه نشان دهنده طراحي صحيح پرايمرها بود. ‏روش AS-PCR اجرا و با توجه به نتايج بسيار خوب به عنوان روش عادي استفاده شد. ‏در مجموع، ‏از 41 سويه كلونيكي مايكوباكتريوم توبركلوزيس مطالعه شده، ‏37 سويه از نظر فنوتيپي (‏به روش كشت proportion) مقاوم به افلوكساسين و 4 سويه حساس به اين دارو بودند. ‏از 37 سويه مقاوم از نظر فنوتيپي، 32سويه با روش AS-PCR مقاوم به افلوكساسين و 5 نمونه حساس تعيين شدند. ‏نتايج تعيين ترادف، ‏با نتايج روش‏هاي استفاده شده انطباق داشت. ‏حساسيت و ويژگي روش به ترتيب ‏معادل ‏11/86 درصد و 100 درصد به دست آمد. بحث و نتيجه‏گيري: نتايج مطالعه حاضر نشان مي‏دهد كه روش AS-PCR طراحي شده مي‏تواند به عنوان يك روش ساده و سريع براي تعيين حساسيت و مقاومت به افلوكساسين در سويه‏هاي مايكوباكتريوم توبركلوزيس استفاده شود. ‏اين روش تا كنون در منابع علمي گزارش نشده است.

Introduction: Resistance to Fluroquinolones drugs are increasingly expanded. A molecular method was designed and compared for rapid detection of resistance to ofloxacin in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Materials and methods: From 136 M. tuberculosis clinical isolates, 41 strains were used for comparison of detection of mutations associated with resistance in gyrA gene by Allele Specific-PCR (AS PCR). Specific internal primers were designed for detecting any changes in 90, 91 and 94 codons. Sequencing method was accomplished for evaluation of the results as gold standard. Results: AS-PCR method could detect mutations by formation or not formation of internal bounds and had good performance. Totally, from 37 strains phenotypically resistant to ofloxacine 32 strains were mutant and 5 strains were non mutant that have Sensitivity and specificity, 86/11% and 100%, respectively. Sequence results were concordant by results molecular methods. Discussion and conclusion: Results of the study showed that AS-PCR method could be used as a routine test for fast detection of resistance to fluroquinolones in M. tuberculosis. Key words: Mycobacterium tuberculosis, Allele Specific-PCR, Ofloxacin