ساخت اينترنال كنترل تشخيص مولكولي ويروس هپاتيت B به روش PCR-Cloning

Internal Control (IC) Construction of Molecular Diagnosis of Hepatitis B Virus by PCR-Cloning

سابقه و هدف: در تشخيص هپاتيت ناشي از ويروس هپاتيتB ) (HBV ، بكارگيري تكنيك هاي آزمايشگاهي حساس و اختصاصي همچون PCR ضروري است. روشهاي سرولوژيكي موجود، قابليت تشخيص سريع و دقيق آلودگي را نداشته درحاليكه روشهاي نوين مولكولي مانند PCR ابزار كارآمدي براي ارزيابي ميزان شيوع HBV مي باشد. بروز نتايج متفاوت در آزمايشگاهها بدليل استاندارد نبودن از معايب اين تكنيك مولكولي قوي است. يكي از مهم ترين موانع در استفاده وسيع از تكنيك PCR تشخيصي، نداشتن اينرنال كنترل مناسب در اكثر تستهاي PCR مي باشد. هدف اين مطالعه طراحي و ساخت اينترنال كنترل پلاسميدي (IAC) جهت شناسايي ممانعت كننده ها در تست PCR ويروس هپاتيت B و كاربردهاي بعدي در آزمايشگاه هاي تشخيصي است. موارد و روش ها: در اين مطالعه براي ساخت اينترنال كنترل داخلي، ابتدا پرايمرهاي ويژه تست PCR، برمبناي ژن هدف HBsAg ويروس هپاتيت B، بهينه و سپس حساسيت و ويژگي مشخص شد. پرايمرهاي مركب (Composite Primer) براي IAC-HBV نيز طراحي و از طريق PCR تكثير و سپس كلون گرديد. تعداد حداقل IC در هر واكنش PCR از طريق رقيق سازي و همين طور طيف پاسخ PCR همراه با IC مورد بررسي قرار گرفت. يافته ها: اندازه محصول تشخيصي HBV با پرايمرهاي اختصاصي آن برابر با bp 262 و محصولIAC-HBV برابر با 660 جفت باز بود، كه از نظر اندازه، اختلاف مطلوب را با هم دارند. تعداد حداقل IC در هر واكنش 1000 عدد تعيين شد. حداكثر حساسيت تست PCR همراه با IC براي DNA ويروس HBV تا شانزده ميليون پارتيكل ويروس مشخص گرديد. در تست ويژگي با عوامل مختلف هيچ محصول ناخواسته اي مشاهده نشد. نتيجه گيري : استفاده از يك اينترنال كنترل در تشخيص مولكولي ويروس HBV به عنوان كنترل داخلي، مي تواند خطاها را شناسايي و باعث استاندارد شدن اين تكنيك حساس شود.

Background and Aim: Using sensitive and specific laboratory techniques such as PCR is necessary on diagnosis of hepatitis which caused by hepatitis B virus (HBV). Common serological methods didn’t have the capability of quick and accurate detection of infection detection thought molecular methods such as PCR are effective tools for evaluation prevalence of HBV. A different result for the reason of not being standard is one of the disadvantages of this rich molecular technique. One of the most significant preventives in widespread usage of diagnostic PCR is not having proper PCR internal controls. The aim of this study is designing and constructing plasmid internal control (IAC) for identification of PCR inhibitors and afterward usage in diagnostic laboratories. Materials and methods: In this study for constructing the internal control, PCR specific primers for HBsAg gene of hepatitis B virus were optimized then sensitivity and specificity were determined. Also Composite Primers for HBV-IAC were designed and amplified by PCR then cloned. Minimum number of IC in each PCR reaction was examined through dilution and PCR results with IC. Result: By using special primers HBV PCR product was 262bp and IAC-HBV product was 660bp which had desirable different in sizes. Minimum number of IC in each reaction was 1000. Maximum of PCR sensitivity with IC for hepatitis B virus DNA was determined as 16 million Particles. In specificity test with different factors no non specific product was observed. Conclusion: For Molecular detection of HBV using an internal control can recognize the errors and will standardize this sensitive technique.