افزايش ويژگي‌هاي عملياتي آنزيم اندوگلوكاناز از طريق تغيير اسيدآمينه‌اي

IMPROVEMENT OF ENDOGLUCANASE ENZYME OPERATING PROPERTIES BY MUTATION IN AMINO ACID

پيش زمينه و هدف: اقتصادي‌ترين نوع اتانول توليدي بيواتانول مي‌باشد كه از مواد گياهي سلولزي كه ارزان قيمت و تجديدپذير هستند تهيه مي‌گردد. در طي اين روند ژن سلولاز در اختيار مخمر قرار مي‌گيرد و توسط آن به خارج از محيط سلول ترشح مي‌گردد سپس بافت‌هاي سلولزي توسط اين آنزيم به گلوكز تجزيه مي‌شوند و توسط مخمر تخمير شده و توليد اتانول مي‌كنند. هدف اين مطالعه اين است كه با استفاده از فن جهش‌زايي هدفمند جهشي در ژن آنزيم سلولاز اعمال شود به طوري كه آنزيم جديد نسبت به آنزيم اصلي قابليت‌هاي صنعتي بالاتري داشته باشد. مواد و روش‌ها: براي اين منظور ژن آنزيم مذكور با ترجيح كدوني مخمر طراحي و در داخل پلاسميد كلونينگ قرار گرفت. سپس توسط فن جهش‌زايي هدفمند جهشي در ژن اعمال گرديد و سپس ژن موجود در پلاسميد براي تكثير به داخل باكتري كلون شد، بعد از استخراج پلاسميد با استفاده از آنزيم‌هاي محدود كننده ژن از پلاسميد كلونينگ جدا و به پلاسميد بياني متصل گرديد در مرحله بعد با كمك الكتروپوريشن به داخل مخمر انتقال پيدا كرد و بعد از بيان پروتيين مورد نظر توسط مخمر خصوصيات آنزيمي از جمله pH و دماي اپتيمم، ثابت ويژگي و مقاومت حرارتي آن‌ها بررسي گرديد. يافته‌ها: جهش اعمال شده تاثيري بر روي دما و pH اپتيمم نداشته ولي باعث بهبود ثابت ويژگي و مقاومت حرارتي آنزيم گرديد. بحث و نتيجه گيري: بهبود دو ويژگي عملياتي آنزيم در كنار ثابت بودن ساير خصوصيات آن منجر به توليد آنزيم جديدي شده است كه قابليت بيشتري براي توليد محصول دارد و در نهايت مي‌تواند منجر به بهبود توليد اتانل در مقياس صنعتي گردد.

Background & Aims: Ethanol produced from plant cellulose is called bioethanol and is recognized as a unique sustainable liquid fuel with powerful economic and environmental effects. In the present study we aimed at integrate a cellulase gene in to yeast genome to have the enzyme secreted out of the cell. Subsequently cellulose is depredated to glucose by the enzyme, and then it is ferment to ethanol. Materials & Methods: Using site directed mutagenesis, one of free cysteines was replaced by a valine residue. The gene with codon optimization in respect to pichia pastoris was sub-cloned in to cloning plasmid, then for amplification it was transformed into E. coli. The plasmid was extracted and excised by restriction enzyme and then was sub-cloned in to expression vector. In the next step using electroporation, gene was transferred in to yeast and recombinant protein was expressed. Enzyme properties like temperature and pH optimum, specific activity, specific constant, and thermostability survived were assessed. Result: Applied mutation did not have any effect on features like pH and temperature optimum but it led to an improvement in catalytic efficiency and thermostability. Conclusion: The mutant enzyme has better properties for industrial application. Keyword: Site direct mutagenesis, Cloning, Bioethanol, Enzymatic biotechnology, Protein engineering