تشخيص موتاسيون هاي موجود در ژن هاي rpoB،inhA و katG در ايزوله هاي كلينيكي مايكوباكتريوم توبركلوزيس با روش Real-time PCR بر اساس Taqman assay و HRM assay

Detection of rpoB, inhA and katG Genes Mutations in Clinical Isolates of Mycobacterium tuberculosis by Real-Time PCR Based on Taqman and HRM Assays

زمينه و هدف: شناسايي سريع بيماراني كه داراي ايزوله هاي مايكوباكتريوم توبركلوزيس مقاوم به دارو هستند امري ضروري براي درمان اين بيماران مي باشد. متاسفانه مقاومت نسبت به دو داروي ايزونيازيد و ريفامپين در سال هاي اخير مطرح شده است. هدف از مطالعه حاضر شناسايي سريع ايزوله هاي كلينيكي مايكوباكتريوم توبركلوزيس مقاوم با استفاده از روش هاي مولكولي بوده است. مطالعه حاضر به منظور مقايسه بين دو روش Real-time PCR بر اساس Taqman assay وHRM assay در تشخيص موتاسيون هاي موجود در ژن هاي rpoB،inhA وkatG در ايزوله هاي كلينيكي مايكوباكتريوم توبركلوزيس انجام گرفت. روش كار: مطالعه حاضر در مركز تحقيقات مايكوباكتريولوژي و در طي سال هاي 92-91 صورت گرفت. تست حساسيت دارويي به ايزونيازيد و ريفامپين با روش پروپورشنال و بر روي 83 نمونه انجام گرفت. سپس روش هاي مالتيپلكس PCR و Real-time PCR بر روي DNA استخراج شده انجام شد. Real-time PCR بر اساس روش هاي Taqman و HRM انجام شد و موتاسيون هاي موجود در ژن هاي rpoB، inhAوkatG مورد بررسي قرار گرفت. يافته ها: بر اساس روش پروپورشنال و مالتيپلكس PCR ، 47 مورد مقاوم به ريفامپين و 35 مورد مقاوم به ايزونيازيد بودند. 30 مورد مقاوم به هر دو داروي ايزونيازيد و ريفامپين بودند. تشابه روش Real-time PCR بر اساس Taqman در تشخيص مقاومت 88% و در تشخيص حساسيت 84% بود. از طرفي تشابه روش Real-time PCR بر اساس HRM در تشخيص مقاومت 96% و در تشخيص حساسيت 30% بود. در روش Taqman در مقايسه با مالتيپلكس PCR ، حساسيت 84% و اختصاصيت 88% به دست آمد. در روشHRM نيز حساسيت 30% و اختصاصيت 96% به دست آمد. نتيجه گيري: نتيجه مطالعه انجام گرفته نشان داد روش Real-time PCR بر اساس Taqman نسبت به روش HRM در تشخيص مقاومت دارويي مايكوباكتريوم توبركلوزيس، از حساسيت بيشتري برخوردار بوده است و روشي سريع، مقرون به صرفه (اقتصادي)، دقيق و با حساسيت و اختصاصيت بالا مي باشد.

Background & objectives: The rapid identification of patients carrying resistant Mycobacterium tuberculosis (M.TB) isolates is important for effective tuberculosis therapy. Unfortunately, during the recent years considerable numbers of isolates showed resistant to Rifampin (RIF) and Isoniazid (INH). The aim of this study was to rapidly identify resistant MTB isolates using molecular method. For this reason, the comparison between real-time PCR based on Taqman and HRM AssayS in detection of rpoB, inhA and katG genes mutation in clinical isolates were performed and analyzed. Methods: The study carried out on Mycobacteriology Research Center (MRC) from 2012-2013. Classical susceptibility testing i.e., proportional method against INH and RIF was performed on eighty three M.TB isolates. Thereafter, multiplex and real-time PCR were performed on extracted DNA sample. The real-time PCR was based on Taqman and HRM assays. Mutation in genes rpoB, inhA and katG were detected. Results: In overall, based on proportional and multiplex PCR method, 47 and 35 isolates were resistant to RIF and INH, respectively. Thirty of strains were resistant to both RIF and INH. The agreement of real-time PCR using Taqman was 88% for resistant and 84% for susceptible isolates, whereas the agreement of HRM was 96% and 30%, respectively. The sensitivity and specificity of Taqman in comparison to multiplex were 84% and 88%, respectively. In addition, the sensitivity and specificity of HRM were 30% and 96%, respectively. Conclusion: Results documented that real-time PCR based on Taqman assay is more sensitive than HRM assay. Additionally, real-time PCR based on Taqman assay is a rapid, accurate and cost effective method in detection of Mycobacterium tuberculosis resistance.