بررسي گياهان ترانسپلاستوميك نسل اول (T1)توتون حاوي ژن اينترفرون گاماي انساني (hIFNg)

Study of T1 Tobacco Transplastomic Plants Containing Human Gamma Interferon Gene (hIFNg)

در دهه‌هاي اخير، پيشرفت در بيوتكنولوژي گياه، بويژه زراعت مولكولي امكان استفاده از گياهان را به عنوان يك سيستم توليد جديد و راكتور زيستي براي محدوده‌ي وسيعي از پروتيين‌هاي نوتركيب فراهم كرده است. اينترفرون گاماي انساني ‌يكي از پروتيين‌هاي ارزشمند دارويي مي‌باشد كه كاربردهاي پزشكي وسيعي در زمينه‌هاي تشخيصي و درماني پيدا كرده است. كلونينگ ژن اينترفرون گاماي انساني به همراه ژن مقاومت به آنتي‌بيوتيك اسپكتينومايسين - استرپتومايسين با استفاده از ناقل كلروپلاستي pKCZ در آزمايشگاه بيوتكنولوژي دانشكده كشاورزي دانشگاه تربيت مدرس صورت گرفته و سپس به روش بيولستيك به كلروپلاست گياه توتون انتقال يافته است. هدف از انجام اين تحقيق بررسي پايداري بيان ژن اينترفرون گاماي انساني در گياهان ترانسپلاستوميك نسل اول توتون بود. گياهان رشد كرده در سطح محيط انتخابگر، در سطوح مختلف (DNA، RNA و پروتيين) به منظور تاييد درج و بيان ژن مورد بررسي قرار گرفتند. بررسي اين گياهان در سطح DNA با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي ژن اينترفرون گاما و تكنيك PCR صورت پذيرفت، نتايج حاصل درج اين ژن را در ژنوم كلروپلاستي گياهان تاييد كرد، به علاوه با آزمون RT-PCR رونويسي ژن هدف تاييد شد. همچنين به منظور بررسي بيان ژن هدف در سطح پروتيين، آزمون‌هاي SDS-PAGE، Dot-blot و Western-blot انجام شد و نتايج بدست آمده، بيان اين ژن را در سطح پروتيين تاييد كرد. در نهايت به منظور تعيين ميزان بيان ژن اينترفرون گاماي انساني آزمون ELIZA انجام شد. نتايج نشان داد كه بالاترين سطح تجمع اينترفرون گاما در گياهان ترانسپلاستوميك بالاي 2/0% پروتيين محلول كل مي‌باشد

In the recent decades the progress in plant biotechnology, especially in the field of molecular farming, has made it possible to produce a wide range of recombinant protein using plants as a novel production system and bioreactor. human gamma interferon is one of the valuable pharmaceutical proteins which has found wide medical applications in diagnosis and therapeutic. Cloning of human gamma interferon gene associated with spectinomycin-streptomycin antibiotic resistance gene using chloroplast pKCZ vector has been performed at agricultural biotechnology laboratory of Tarbiat Modares University and has been transferred into the tabacco chloroplast genome with biolistic method. The purpose of this study is to determine gamma interferon gene expression stability in T1 tobacco transplastomic plants. plants, which are grown on selective media, were analysed at different levels of (DNA, RNA and protein) to confirm integration and expression of the gene into the tobacco chloroplast. Analysis of plants was performed at DNA level by using of PCR and specific primers for human gamma interferon gene, results confirmed integration of this gene into the chloroplast genome. In addition, transcription of target gene was confirmed by RT-PCR. In order to study expression of target gene at protein level SDS-PAGE, Dot blotting and Western-blot were also done and the obtained results show target gene expression at protein level. Finally, ELISA test was done to determine quantity of gamma interferon gene expression. Results indicated that the highest gamma interferon level in transplastomic plant is up to 0.2% of total soluble protein.