ساب كلونينگ قطعه تك زنجيره‌اي ناحيه متغير آنتي بادي بر ضد گيرنده CD4 انساني نشان دار با پروتيين فلورسنت سبز در پلاسميد pET26b

Subcloning of the Single Chain Variable Fragment of Anti Human CD4 Receptor Fused to Green Fluorescent Protein in pET26b Plasmid

آنتي بادي?ها ابزارهاي قدرتمندي براي مطالعه?ي عملكرد، مكان يابي و ميان كنش پروتيين?ها هستند. هم چنين اين مولكولها به طور گسترده براي اهداف تشخيصي و درماني نيز به كار مي روند.آنتي باديها معمولاً براي اهداف تحقيقاتي و تشخيصي با مولكولهاي فلورسنت نشاندار مي‌گردند. اگر مولكول فلورسنت مورد نظر يك پروتيين نوتركيب باشد در اين حالت مولكول حاصله فلوبادي ناميده ميشود. در مطالعه حاضر، قطعه تك زنجيرهاي ناحيه متغير يك آنتي بادي بر ضد گيرنده CD4 انساني?كه به پروتيين فلورسنت سبز متصل شده است، توسط دو آنزيم IEcoR و NcoI از پلاسميد IpAB استخراج گرديد. سپس?قطعه مورد نظر به منظور افزايش بيان پروتيين در پلاسميد pET26b كلون شده و پلاسميد نوتركيب ايجاد شده در باكتري?اشرشيا كلي ترانسفورم گرديد. ورود قطعه مذكور به داخل پلاسميد pET26b به وسيله واكنش كلني-PCR و هضم دوگانه تاييد شد. هم چنين بيان فلوبادي نيز توسط روش دات بلات تاييد گرديد. فلوبادي نوتركيب حاضر يك آنتي بادي?با عملكرد دوگانه بوده كه به طور همزمان ويژگي اتصال به آنتي ژن و فلورسنت خود را حفظ كرده است. بنابراين انتخاب پلاسميد مناسب مانند pET26b براي توليد مقادير زياد اين فلوبادي براي اهداف ما ضروري به نظر مي رسد.

Antibodies are powerful tools to study the function, localization, and interaction of proteins. These molecules are also widely used for diagnostic and therapeutic purposes. Antibodies are usually conjugated to fluorescent molecules for research and diagnostic purposes. If these fluorescent molecules are conjugated to a recombinant fluorescent protein, the combination is known as the fluobody. In this study, an anti-human CD4 single-chain variable fragment antibody fused to a green fluorescent protein was extracted from pAB1 plasmid with two restriction enzyme EcoRI and NcoI. Then, the fragment was cloned into pET26b plasmid in order to increase its expression, and the recombinant plasmid was then transformed into Escherichia coli. Insertion of this fragment into pET26b plasmid was confirmed by colony PCR and double digestion. Also, the expression of fluobody was confirmed by dot blotting. The expressed recombinant floubody is a bifunctional antibody which retains both antigen binding activity and its fluorescence simultaneously. Selection of an appropriate plasmid such as pET26b for high production of fluobody seems to be essential in order to obtain high levels of the protein.