ميزان بيان پلي‌مورفيسم D299G و T399I ژن TLR4 در رده سلولي سرطان كولوركتال به روش فلوسايتومتري

Expression of T399I and D299G polymorphisms of TLR4 gene in colorectal cancer cell line by flowcytometery

زمينه و هدف : گيرنده‌هاي شبه Toll (TLRs) به عنوان مهم‌ترين گيرنده‌ها در ايمني ذاتي شناخته شده‌اند. گيرنده TLR4 به عنوان گيرنده اصلي در شناسايي ليپوپلي‌ساكاريد (LPS) باكتري‌هاي گرم منفي عمل مي‌كند. دو پلي‌مورفيسم rs4986790) D299G (SNP و (SNP rs4986791) T399I در ژن اين گيرنده موجب كاهش پاسخ‌دهي به LPS مي‌شود. اين مطالعه به منظور تعيين ميزان بيان پلي‌مورفيسم‌هاي مختلف ژن TLR4 در رده سلولي سرطان كولوركتال HT29 ، HCT116 و CaCo2 به روش فلوسايتومتري انجام شد. روش بررسي : در اين مطالعه آزمايشگاهي انتقال پلاسميد حاوي ژن واريته‌هاي مختلف شامل Flag-tagged-TLR4وحشي، Flag-tagged D299G و Flag-tagged T399I موتان به سلول‌هاي HCT116 توسط معرف Turbofect صورت گرفت. راندمان انتقال ژن توسط پلاسميد GFP ارزيابي شد. ميزان بيان واريته‌هاي مختلف TLR4 در سلول‌هاي دريافت كننده ژن‌ها از طريق فلوسايتومتري بررسي شد. داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار آماري SPSS-11.5 و آزمون Chi-Square تجزيه و تحليل شدند. يافته‌ها : رده‌هاي سلولي HT29 و CaCo2گيرنده TLR4 را در سطح پاييني بيان كردند. در حالي كه سلول‌هاي HCT116 قبل از انتقال پلاسميد، ژن TLR4 را در سطح قابل رديابي به روش فلوسايتومتري بيان نكردند. راندمان انتقال ژن GFP به داخل سلول‌هاي HCT116 به‌وسيله آناليز ميكروسكوپي و فلوسايتومتري حدود 80 درصد اندازه‌گيري شد. براين اساس ميزان بيان TLR4و پاسخ‌دهي به LPS در سلول‌هايي كه ژن واريته وحشي TLR4 را دريافت كردند؛ به‌طور معني‌داري بيشتر از سلول‌هايي بود كه ژن واريته موتان را دريافت كردند (05/0P < ). نتيجه‌گيري : سطح پايين بيان TLR4 روي سلول‌هاي داراي نوع موتان گيرنده نشان داد كه اين پلي‌مورفيسم‌ها روي بيان گيرنده در سلول‌هاي سرطان كولون اثر دارند.

Background and Objective: Toll-like receptors (TLRs) have been discovered as the most important receptors in innate immunity. One of the most important TLRs is TLR4, the key receptor for the LPS component of gram-negative bacteria. Two polymorphisms, D299G (rs4986790) and T399I (rs4986791), in TLR4 gene are associated with a decreased response to LPS. This study was done to estimate the expression of different polymorphisms of TLR4 gene in colorectal cancer cell line by flowcytometery. Materials and Methods: In this laboratory study, the HCT116 cells were transfected with plasmids containing different variants of TLR4 gene including; Flag-tagged-TLR4 wild type, flag-tagged D299G and T399I Using TurboFect transfection reagent. Transfection efficiency was evaluated by GFP plasmid. Expression of different variants of TLR4 was assessed in transfected cells by flowcytometery. Data were analyzed using SPSS-11.5 and chi-square test. Results: TLR4 was detected on HT29 and CaCo2 cell lines at low levels. HCT116 cells did not express detectable amounts of TLR4 by flowcytometery prior to transfection. Gene transfer efficiency for GFP plasmid was about 80% in HCT116 cells by flowcytometery and microscopic analysis. TLR4 expression and LPS responsiveness significantly was higher in HCT116 cells which were transfected with wild type TLR4 gene compared to non-transfected and mutant transfected cells (P < 0.05). Conclusion: Lower expression of TLR4 on cells with mutant TLR4 showed that these polymorphisms affect on expression patterns of TLR4 on colon cancer cells.