كشت آزمايشگاهي سلول‌هاي بنيادي ليمبال: بهره‌گيري از سلول‌هاي بنيادي سوماتيك خون بندناف به عنوان لايه حمايت كننده از سلول‌هاي بنيادي ليمبال

Ex Vivo Culture of Limbal Stem Cells: Unrestricted Somatic Stem Cell from Umbilical Cord Blood Serving as a Limbal Stem Cell Feeder Layer

هدف: معرفي لايه تغذيه‌كننده نويني با منشا انساني به منظور تسهيل كشت سلول‌هاي بنيادي. روش پژوهش: سلول‌هاي بنيادي سوماتيك خون بندناف از مادران با دوران كامل بارداري جداسازي شد. بيان نشانگرهاي سطحي سلول بنيادي نظير CD105,CD90, CD73, CD44,CD34,CD45 با روش فلوسيتومتري بررسي شدند. سلول‌هاي بنيادي ليمبال بر روي دو لايه تغذيه كننده كه با ميتومايسين C فعاليت ميتوزي آن‌ها متوقف شده بود، كشت يافته و با استفاده از ميكروسكوپ، مرحله كنتراست مورفولوژي سلول‌هاي بنيادي ليمبال مورد ارزيابي قرار گرفت. بيان نشانگرهاي اختصاصي سلول بنيادي ليمبال:19, KRT3P63, ABCG2,Involucrin, Vimentin,CX43, KRT با استفاده از روش ايمونوسيتوشيمي و Real-Time PCR بررسي شد. كروموزوم‌ها نيز پس از همجواري مورد ارزيابي كاريوتايپ قرار گرفتند. يافته‌ها: سلول‌هاي بنيادي سوماتيك خون بندناف داراي شكل دوكي با سرعت تقسيم بالا مي‌باشند. بيان نشانگرهاي سطحي بنيادي در آن‌ها مثبت بوده و نتايج نشان داد كه سلول‌هاي بنيادي ليمبال كشت يافته بر سطح USSC داراي بيان مثبت براي P63ABCG2, KRT19،Involucrin, Vimentin, مي‌باشند كه با Real-Time PCR نيز مورد تاييد قرار گرفت. نتايج بيان در گروه لايه تغذيه‌كننده 3T3 و USSC با يكديگر مشابه بودند. نتايج كاريوتايپ نيز پس از گذشت 10 پاساژ متوالي، 44XX را نشان داد. نتيجه‌گيري: سلول‌هاي بنيادي مشتق از خون بندناف توانستند حمايت از سلول‌هاي بنيادي ليمبال را بطور كامل و حتي مناسب‌تر از رده سلولي 3T3 انجام دهند. از اين جهت كه سلول‌هاي لايه تغذيه كننده USSC منشا انساني دارد، داراي مزيت عمده نسبت به 3T3 مي‌باشند.

Purpose: The 3T3 feeder layer cells are commonly used for stem cell maintenance and expansion. Although feeder free systems are recently being developed for embryonic stem cells culture, deciphering the ability of new sources of feeder cells is still important for accurate expansion of epithelial stem cells. This study was aimed to introduce a new feeder layer for the culture of human limbal stem cells which can be applied for therapeutic corneal regeneration. For this purpose, the potential of unrestricted somatic stem cells (USSCs) isolated from umbilical cord blood was investigated. Methods: Human limbal stem cells were co-cultured with mouse 3T3 fibroblasts in addition with human unrestricted somatic stem cell (USSC), isolated from full term-pregnant women. The expression of surface markers including CD73, CD90, CD105, CD45, CD34, and CD44was evaluated using flowcytometry. Lmbal stem cells were cultured on two feeder layers in which mitotic activities were inhibited using mitomycin C. The morphology of cultured cells was assessed using phase-contrast microscopy. Furthermore, stem cell characteristics were assessed using immunocytochemistry and real-time PCR for stem cell markers including p63, KRT19, KRT3, Cx43, vimentin, involucrin and ABCG2. Additionally, chromosomal karyotype analysis was preformed. Results: Cord blood somatic stem cells with spindle-shaped morphology can be quickly split up. The results demonstrated that limbal stem cells cultured on USSC surface were positive for ABCG2, p63 and KRT19. These results were confirmed by real-time PCR analysis. Limbal stem cells grown on a USSC feeder layer maintained a stem cell-like phenotype, comparable to cells grown on a 3T3 feeder layer. Karyotype analysis of USSCs and Limbal stem cells represented a normal 44XX karyotype. Conclusion: USSC could successfully support the growth of human limbal stem cells even better than 3T3 feeder cells. Since USSC are derived from human beings, it has an advantage over 3T3.