اثر فلاونوئيد تام موجود در عصاره متانولي برگ كاسني بر القاي تمايز سلول‌هاي بنيادي 19P به سلول‌هاي انسولين‌ساز

Effect of flavonoids of extract of cichorium intybus L. leaf on induction of P19 stem-cells differentiation to insulin-producing cells

سابقه و هدف: با توجه به نقش مؤثر فلاونوئيدهای گياهی در پيشگيری و درمان ديابت قندی، در اين پژوهش القای تمايز سلول‌های بنيادی 19P به سلول‌های انسولين‌ساز تحت تأثير فلاونوئيد تام عصاره متانولی برگ كاسنی مورد بررسی قرار گرفت. مواد و روش‌ها: ابتدا عصاره متانولی از فلاونوئيدهای برگ گياه كاسنی تهيه و سپس تعيين غلظت شد. اجسام شبه جنينی (Embryoid bodies يا EB) حاصل از كشت معلق سلول‌های 19P در محيط كشت α-MEM حاوی 15 درصد سرم جنين گاو به مدت سه روز كشت داده شدند. به منظور القای تمايز اين سلول‌ها، به مدت 12 روز با غلظت‌های 50، 100 و 200 ميكروگرم بر ميلی‌ليتر فلاونوئيد تام عصاره متانولی برگ كاسنی تيمار شدند. سلول‌های 19P و اجسام شبه جنينی تيمار نشده به عنوان شاهد در نظر گرفته شد. از تكنيك‌های رنگ‌آميزی ديتيزون (Dithizone يا DTZ)، ايمنوفلورسنس و RT-PCR (Real-time polymerase chain reaction) جهت شناسايی سلول‌های تمايز يافته استفاده شد. يافته‌‌ها: سلول‌های 19P تمايز يافته با غلظت‌های مختلف عصاره نسبت به رنگ‌آميزی ديتيزون پاسخ مثبت دادند. بيشترين درصد سلول‌های ديتيزون مثبت در غلظت 100 ميكروگرم بر ميلی‌ليتر عصاره حاصل شد. روش ايمنوفلورسنس نشان داد كه سلول‌های 19P تمايز يافته قادر به بيان نشانگرهای اختصاصی سلول‌های بتای پانكراس هستند. بيان ژن Pdx-1 (Pancreatic duodenal homeobox-1) در اين سلول‌ها توسط تكنيك RT-PCR به اثبات رسيد. استنتاج: فلاونوئيد تام عصاره متانولی برگ كاسنی قادر به القای تمايز سلول‌های بنيادی 19P به سلول‌های انسولين‌ساز است.

Background and purpose: Regarding the effective role of plant flavonoids in the prevention and treatment of diabetes mellitus, in this investigation, induction of P19 stem cells differentiation into insulin producing cells by flavonoids of methanol extract of Cichorium intybus L. leaf was examined. Materials and methods: Initially, flavonoids of methanol extract of Cichorium intybus L. leaf were concentrated. The P19-derived embryonic bodies were cultured in α-MEM (Minimum Essential Medium) containing 15% fetal bovine serum for three days. To induce the differentiation, the cells treated with the concentrations of 50, 100 and 200 µg/ml of flavonoids of methanol extract of Cichorium intybus L. leaf for 12 days. Untreated P19 cells and embryonic bodies were used as controls. Dithizone staining, immunoflorecence and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) techniques were used to demonstrate the differentiated cells. Results: Differentiated P19 cells by different concentrations of extract shown positive reaction to dithizone staining. Most percentage of positive dithizone cells was reached in concentration of 100 µg/ml. Immunoflorecence method showed that differentiated P19 cells were able to express the pancreas beta cell-specific markers. Pdx-1 gene expression in the cells was demonstrated by RT-PCR technique. Conclusion: The flavonoids of methanol extract of Cichorium intybus L. leaf are able to induce differentiation of P19 stem cells to insulin producing cells.