الگوي بيان hsa-miR-133b طي روند تمايز سلول‏هاي پيش‏ساز قلبي و تاثير مهاري آن بر بيان ژن عامل پاسخ سرم

Hsa-miR-133b Expression Profile during Cardiac Progenitor Cell Differentiation and its Inhibitory Effect on SRF Expression

هدف: تمايز سلول‏هاي بنيادي قلب با كمك ميكروRNA‏ها، دريچه جديدي را براي ترميم انفاركتوس قلبي گشوده است.miR-1-2/133a-1 و miR-206/133b دو خوشه مجزا از خانواده ميكروRNA‏ها هستند كه به ترتيب در ماهيچه‏هاي قلبي و اسكلتي بيان مي‏شود. چون miR-133b و miR-133a تنها در يك نوكليوتيد اختلاف دارند، احتمالاً مسيرها وmRNA هاي يكساني را مورد هدف قرار مي‏دهند. هدف تحقيق حاضر، بررسي بيان احتمالي miR-133b در سلول‏هاي در حال تمايز قلبي و نيز تاثير احتمالي آن بر دو ژن هدف دخيل در تمايزسلول‏هاي قلبي است. مواد و روش‏ها: سلول‏هاي بنيادي قلب انسان از بانك سلولي پژوهشكده رويان (RSCB) تهيه و ابتدا با عامل دمتيلاسيون (5- azacytidine) به مدت سه روز تيمار و سپس يك روز در ميان با اسيد آسكوربيك و دو بار در هفته با پروتيين TGF-B1 تيمار شدند. در نهايت در هفته چهارم، روش‏هاي ايمنوسيتوشيمي، فلوسيتومتري و Real-Time PCR براي برخي عوامل رونويسي قلبي، تمايز سلول‏هاي بنيادي به سلول‏هاي قلبي را تاييد نمود. سپس الگوي بياني hsa-miR-133b و نيز دو ژن هدف عامل پاسخ سرم (SRF) و CCND2 (از ژن‏هاي كنترل كننده چرخه سلولي) طي مراحل تمايزي اين سلول‏ها بررسي شد. نتايج: سه هفته پس از شروع روند تمايز، سطح بيان hsa-miR-133b حدود پنج برابر سطح آن در هفته اول بود (05/0P < ). برعكس و طبق انتظار، بيان ژن عامل پاسخ سرم به ترتيب افزايش و كاهش را در هفته اول و سوم نشان داد (05/0P < ). نتيجه‏گيري: با توجه به اين‏كه در هفته سوم روند تمايزي، سطح بيان hsa-miR-133b افزايش و سطح رونوشت ژن عامل پاسخ سرم كاهش يافته است، و از آن‏جا كه عامل پاسخ سرم در تكثير سلولي دخيل است، افزايش سطح miR-133b مي‏تواند منجر به كنترل چرخه سلول‏هاي پيش‏ساز قلبي و تمايز ماهيچه قلبي شود. در نهايت نتايج پيشنهاد مي‏كند كه hsa-miR-133b به همراه hsa-miR-133a مي‏تواند در تمايز سلول‏هاي قلبي دخيل باشد.

Objective: Cardiac cell differentiation with the help of miRNAs has recently opened a promising window for the restoration of myocardial infarction. Independent miR-1-2/133a-1 and miR-206/133b clusters are known to be expressed in cardiac and skeletal muscles, respectively. miR-133b differs from miR-133a by only one nucleotide. The sequence similarity of these two miRNAs suggests that they target the same pathways and similar mRNA targets. The present study seeks to determine if miR-133b is expressed during the cardiac cell differentiation and if its expression is in reverse correlation with the SRF and CCND2 (as potential target genes) expression patterns. Methods: Human cardiac progenitor cells were prepared from Royan Stem Cell Bank (RSCB) and differentiated into cardiomyocytes. To initiate differentiation, cells were treated with 5-azacytidine as a demethylation factor. Then, ascorbic acid and TGFB1 were added every other day and twice per week, respectively. Differentiation into cardiomyocytes was confirmed by immunocytochemistry (ICC), flow cytometry and real-time PCR for some of the cardiac marker genes. The expression profiles of hsa-miR-133b and two of its potential target genes were also analyzed during the cardiac differentiation. Results: Three weeks after the first differentiation induction, expression level of hsa-miR-133b was approximately five times higher than early stage expression (p < 0.05). During this process, the expression profile of SRF target gene was inversely correlated with hsa-miR-133b expression. Conclusion: It is known that SRF is critically involved in the cell cycle. Considering increased miR-133b and decreased SRF expression levels during the late stages of heart cell differentiation, here we speculate that elevated expression of miR-133b blocks SRF expression and decreases cardiomyocytes proliferation in order to induce differentiation with direct targeting of SRF. Taken together, our data suggest that miR-133b along with miR-133a may be involved in cardiomyocytes differentiation.