افزايش بيان عامل فعال كننده پلاسمينوژن بافتي نوتركيب در سلول‏هاي CHO با استفاده از ناقل بياني حاوي نواحي متصل شونده به ماتريكس و روش فعال‏سازي راه‏انداز

Enhancement of Recombinant Human Tissue Plasminogen Activator Expression in CHO Cells using Matrix Attachment Region Containing Vectors in Combination with Promoter Activation Strategy

هدف: ايجاد رده‏هاي سلولي داراي بيان بالا يك مرحله محدود كننده اصلي در روند توليد پروتيين‏هاي نوتركيب دارويي است. در اين مطالعه اثر به‏كارگيري ناحيه متصل شونده به ماتريكس ژن اينترفرون بتاي انساني به‏همراه روش فعال‏سازي راه‏انداز از طريق پروتيين E1A 13S بر بيان فاكتور فعال كننده پلاسمينوژن بافتي (t-PA) در سلول‏هاي تخمدان هامستر چيني بررسي شده است. مواد و روش‏ها: ناحيه متصل شونده به ماتريكس در سمت ?5 و?3 واحد بيان كننده t-PA در ناقل pTPA كلون شد تا ناقل pMTPA به‏دست آيد. پس از ترانسفكشن سلول‏ها با ناقل‏هاي pTPA و pMTPA، رده‏هاي سلولي پايدار ايجاد شده و ميزان بيان t-PA براي هر رده تعيين شد. در مرحله بعد، پلاسميد بيان كننده E1A 13S به سلول‏هاي پايدار ترانسفكت شده و ميزان بيان t-PA پس از 72 ساعت اندازه‏گيري شد. نتايج: الحاق ناقلين pTPA و pMTPA به ژنوم سلول CHO از طريق انجام PCR روي DNA ژنومي سلول‏هاي پايدار تاييد شد. بررسي ميزان بيان t-PA افزايش بيان به‏ميزان سه برابر را در سلول‏هاي ترانسفكت شده با ناقل pMTPA در مقايسه با رده ايجاد شده با pTPA نشان داد. بيان موقتي E1A 13S در رده‏هاي پايدار منجر به افزايش تيتر t-PA به 1771 واحد در هر ميلي‏ليتر در سلول‏هاي ايجاد شده با ناقل pMTPA شد. نتيجه‏گيري: نتايج اين تحقيق نشان‏دهنده آنست كه به‏كارگيري ناحيه متصل شونده به ماتريكس در ناقل بياني به‏همراه روش فعال‏سازي راه‏انداز مي‏تواند به‏صورت موثر ميزان بيان پروتيين‏هاي نوتركيب در سلول‏هاي CHO را افزايش دهد.

Objective: Development of high producing mammalian cell lines is a major bottleneck in manufacturing of recombinant therapeutic proteins. This study examines the effect of using the matrix attachment region from the human interferon beta gene in combination with promoter activation strategy with E1A 13S protein on human tissue plasminogen activator (t-PA) expression in Chinese hamster ovary (CHO) cells. Methods: The matrix attachment region was cloned in 3? and 5? flanking sides of the t-PA expression cassette in pTPA vector to generate pMTPA. After transfection of the cells with pTPA and pMTPA vectors, stable cell pools were developed and the t-PA expression level determined for each stable cell line. In the next step, E1A 13S expression plasmid was transfected to stable cell pools and t-PA titers were measured after 72 hours. Results: Integration of pTPA and pMTPA vectors in the CHO genome was confirmed by PCR analysis on genomic DNA of stable cell pools. Analysis of the t-PA expression level showed a three-fold enhancement in pMTPA transfected cells compared to pTPA-containing cells. t-PA expression was further enhanced up to 1771 U/ml by transient expression of E1A 13S in pMTPA stable cell pools. Conclusion: These results have shown that incorporation of matrix attachment region in an expression vector in combination with promoter activation can effectively enhance recombinant protein expression levels in CHO cells.