كلونينگ و توالي‌يابي پلاسميد كد كننده پروتئين گرانولي متراكم 14 سويه RH توكسوپلاسما گونديي

Cloning and sequencing the plasmid encoding dense granule antigen 14 (GRA14) of Toxoplasma gondii RH strain

سابقه و هدف: بيماری توكسوپلاسموز از بيماری‌های شايع در جهان می‌باشد كه حدود يك سوم مردم دارای آنتی‌بادی بر عليه توكسوپلاسما هستند. اين بيماری بيشتر به دليل عوارض وخيم آن، در موارد مادرزادی و نيز بيماران نقص سيستم ايمنی اهميت دارد. ژن كد كننده پروتئين 14GRA می‌تواند به عنوان يك هدف مناسب جهت ساخت DNA (Deoxyribonucleic acid) واكسن و همچنين طراحی كيت تشخيصی مورد ارزيابی قرار گيرد. هدف از اين بررسی، شناسايی و كلون كردن ژن كد كننده پروتئين 14GRA سويه RH توكسوپلاسما گونديی بود. مواد و روش‌ها: در مرحله اول پس از جداسازی تاكی‌زوئيت‌های توكسوپلاسما از مايع صفاقی موش آلوده، DNA آن استخراج شد و پس از انجام PCR (Polymerase chain reaction)، محصول تكثير شده بر روی ژل الكتروفورز بررسی گرديد. سپس ژن حاصل در وكتور pTG19-T كلون گرديد. جهت تأييد از روش‌های Colony-PCR و هضم آنزيمی به وسيله آنزيم‌های محدود كننده HindIII و EcoRI استفاده شد. در نهايت ژن 14GRA كلون شده در وكتور pTG19-T مورد تعيين توالی قرار گرفت. يافته‌ها: بررسی واكنش PCR بر روی ژل الكتروفورز و همچنين تعيين توالی ژن كد كننده پروتئين 14GRA نشان داد كه اين ژن 1227 جفت بازی با ژن 14GRA سويه RH ثبت شده در ژن بانك تشابه كامل داشت. علاوه بر اين، با استفاده از روش‌های هضم آنزيمی و Colony PCR كلون شدن، ژن 14GRA در پلاسميد pTG19-T مورد تأييد قرار گرفت. استنتاج: ژن 14GRA به طور موفقيت‌آميزی در پلاسميد pTG19-T كلون شد و اين پلاسميد می‌تواند برای مطالعات بعدی جهت ساخت واكسن DNA و طراحی كيت تشخيصی مورد استفاده قرار گيرد.

Background and purpose: Toxoplasmosis is a common parasitic disease throughout the world and ‎one-third of the population has antibodies to Toxoplasma gondii. This disease causes serious medical ‎problems in fetuses and immunocompromised individuals. As gene encoding protein GRA14 can be ‎considered as a suitable target for DNA vaccine and designing diagnostic kits; the aim of this study was to do ‎cloning and sequencing the gene encoding GRA14 protein of Toxoplasma gondii RH strain.‎ Materials and methods: DNA extraction was performed on harvested tachyzoites from mouse ‎peritoneal fluid, then PCR carried out and amplification products were analyzed by gel electrophoresis. ‎GRA14 gene was cloned in pTG19-T as a cloning vector, then recombinant plasmid confirmed by the colony-‎PCR and restriction enzyme digestion using HindIII and EcoRI, followed by sequencing.‎ Results: Evaluation of PCR products by agarose gel electrophoresis and analysis of nucleotide ‎sequencing of 1227 bp gene encoding the protein GRA14, revealed the complete homology with the recorded ‎sequences in the gene bank. Furthermore, cloning of GRA14 gene in pTG19-T vector was confirmed with ‎colony PCR and restriction enzyme digestion.‎ Conclusion: The results showed that the GRA14 gene was successfully cloned into the pTG19-T ‎vector and this plasmid can be used to design DNA vaccines and diagnostic kits in further studies.‎