شناسايي مولكولي لپتوسپيراهاي بيماري‌زا به‌روش واكنش زنجيره پليمراز بر مبناي ژن ligB

Detection of pathogenic Leptospira spp. By polymerase chain reaction reaction (PCR) targeting ligB gene

زمينه: لپتوسپيروز بيماري عفوني مي‌باشد كه به‌عنوان مهم‌ترين بيماري زيونوز شايع در جهان مطرح شده است. LigBيكي از مهم‌ترين پروتيين‌هاي غشا خارجي لپتوسپيرا مي‌باشد، ايمونوژن مي‌باشد و تنها در لپتوسپيراهاي بيماري‌زا وجود دارد. هدف اين پژوهش تشخيص مولكولي لپتوسپيراهاي بيماري‌زا به‌روش PCR بر مبناي ژن ligB مي‌باشد. مواد و روش‌ها: در اين بررسي از پنج سرووار بيماري‌زاي لپتوسپيرا و يك سرووار غير بيماري‌زا استفاده گرديد. باكتري‌ها در محيط كشت اختصاصي كشت داده شدند و DNA ژنوميك آن‌ها تخليص گرديد. پرايمرهاي اختصاصي جهت تكثير ژنligB طراحي و حساسيت و ويژگي آن در PCR بررسي شد. يافته‌ها: با توجه به داده‌هاي PCR مشخص شد كه اين ژن فقط در سرووارهاي گونه بيماري‌زا حضور دارد و قطعه bp 1041 حاصل كه نشان‌دهنده تكثير ژن ligBمي‌باشد، در گونه غيربيماري‌زاي بايفلكسا مشاهده نگرديد. نتيجه‌گيري: بيماري لپتوسپيروز در مناطق معتدل و مرطوب كه داراي بارندگي زياد بوده داراي شيوع بيشتري است و به‌علت كند رشد بودن اين باكتري، جداسازي آن از نمونه‌هاي باليني به‌روش كشت بسيار مشكل و زمان‌بر است. بنابراين يك آزمايش تشخيصي مولكولي مناسب با ويژگي و حساسيت بالا مانند PCRبراي تشخيص درست، به‌موقع و سريع اين بيماري داراي اهميت مي‌باشد.

Background: Leptospirosis is an emerging infectious disease and is considered to be the most widespread zoonotic disease in the world. LigB is an immunogenic outer membrane protein. The leptospiral ligB gene expressed only in pathogenic Leptospira spp. The aim of this study was molecular diagnosis of pathogen Leptospires by PCR based on ligB gene. Materials and Methods: Five pathogenic Leptospires: L. canicola, L. grippotyphosa, L. pomona, L. icterohaemorrhagiae, L. serjoe hardjo and saprophytic L. biflexa were used in this study. The bacteria were inoculated into the selective culture medium and extraction of the genomic DNA was performed by standard Phenol-Chlorophorm method. The specific primers for proliferation of ligB gene were designed. The specificity and sensitivity of PCR method was evaluated. Results: PCR product was 1041bp which indicated proliferation of ligB gene which was supported using electrophoresis. The PCR based on ligB gene detected all pathogenic reference serovars of Leptospira spp. tested. No PCR products were amplified from the non-pathogenic L. biflexa. Conclusion: Considering the spread of Leptosperosis in moderate and hot areas which have high rate of fall, a proper molecular diagnostic test with high specificity and sensitivity such as PCR is essential. PCR assay with high specificity and sensitivity may prove to be a rapid method for diagnosing acute leptospirosis. The results suggested that the PCR based on ligB gene can be used for detection of pathogenic leptospires.