طراحي پرايمرهاي اختصاصي براي نشان دادن ژن‌هاي exoA، oprL و algD براي تشخيص سريع سويه‌هاي سودوموناس آئروژينوزا در نمونه‌هاي باليني

Designing of the specific DNA primers for detection of the exoA, oprL and algD pathogenicity genes for rapid diagnosis of Pseudomonas aeruginosa

زمينه و هدف: تشخيص سريع سودوموناس آئروژينوزا در سيستيك فيبروزيس، سوختگی‌ها و بيماران با نقص ايمنی از اهميت بسياری برخوردار است. در اين بررسی فراوانی وجود ژن‌‌های exoA، oprL و algD با استفاده از پرايمرهای منتشر شده در مقالات و نيز پرايمرهای اختصاصی طراحی شده در اين تحقيق با روش PCR مورد بررسی قرار گرفت.روش بررسی: نمونه‌های بالينی برای جداسازی سودوموناس آئروژينوزا در محيط‌های باكتريولوژيك كشت داده شد. با روش آناليز بيوانفورماتيكی برای نواحی بسيار ثابت ژن‌های فوق پرايمرهای اختصاصی طراحی شد. با استفاده از پرايمرهای طراحی شده و پرايمرهای منتشر شده در مقالات، نمونه‌ها به‌طور مستقيم با PCR مورد بررسی قرار گرفت.يافته‌ها: تعداد 70 سويه سودوموناس آئروژينوزا در كشت نمونه‌ها جدا شد. با به‌كارگيری پرايمرهای طراحی شده نتايج مثبت PCR به‌ترتيب برای ژن‌های exoA، oprL و algD در 68، 70 و 69 نمونه‌ها به‌دست آمد كه حساسيت به‌ترتيب 2/97%، 100% و 6/98% به دست آمد. در صورتی كه با پرايمرهای منتشر شده نتايج مثبت به‌ترتيب برای ژن‌های فوق در 57، 49 و 28 نمونه به‌دست آمد كه حساسيت به‌ترتيب 5/81%، 70% و 40% محاسبه شد.نتيجه‌گيری: نتايج اين تحقيق نشان داد كه با به‌كارگيری پرايمرهای اختصاصی مناسب در تكنيك PCR معمولی می‌توان با حساسيت و ويژگی بسيار بالا كلونيزاسيون سودوموناس آئروژينوزا در بيماران حساس مانند سيستيك فيبروزيس خيلی زودتر از مثبت شدن كشت نشان داد.

Background: The aim of this study was compared the efficacy of  the designed primers and already published primers for detection of the exoA, oprL and algD genes by PCR assay  for finding a rapid, accurate and highly sensitive and specific procedure to detect the Pseudomonas aeruginosa in the serious and fatal infections such as cystic fibrosis disease, burned individual.Methods: A total of 150 clinical specimens were inoculated in to routine and selective culture media for Pseudomonas aeruginosa isolation. Specific primers were designed by bioinformatics analysis for detection of the virulence genes exoA, oprL and algD. The available sequences of these three genes were obtained from NCBI and multiple alignments were performed to find the conserved sequences of each gene for primer designing. Both multiple alignment and primer designing steps were carried out by AlleleID software, version 7.0.Results: Microbiological culture methods were showed that 70 Pseudomonas aeruginosa strains isolated from the 150 clinical specimens. PCR assay performed by using the designed primers shown 68, 70 and 69 positive results from 70 direct specimens for exoA, oprL and algD respectively that shown 97.2%, 100% and 98.6% sensitivity for above genes. PCR assay performed by using the already published primers shown 57, 49 and 28 positive results for above genes respectively that shown 81.5%, 70% and 40% sensitivity.Conclusion: The present study shows that by using the high specific primers for detection of the mentioned genes of the Pseudomonas aeruginosa. The conventional PCR assay detected the early colonization of the organism in Cystic Fibrosis patients with more sensitivity and specificity before several mounts to obtain positive culture. Indeed PCR assay with high specific primers has more sensitivity and specificity as a rapid and accurate diagnosis of the organism in other deadly infections by using the direct clinical specimens.