ترانسفكشن سلول‏هاي كبدي به‏وسيله DNA كلون شده ويروس هپاتيت B و ارزيابي ميزان رونويسي و بيان نشانگرهاي اختصاصي ويروسي و ژن‏هاي القا كننده اينترفرون

Transfection of a Hepatoma Cell Line by Cloned HBV DNA and Evaluation of Transcription and Expression of Viral-specific Markers and Interferon Stimulated Genes

هدف: با وجود اين‏كه واكسن موثري عليه ويروس هپاتيت B وجود دارد، شيوع جهاني عفونت با اين ويروس كاهش چشمگيري پيدا نكرده است. ويروس هپاتيت B برخلاف بسياري از ويروس‏هاي بيماري‏زا در انسان قابليت كشت در آزمايشگاه را ندارد؛ اما ترانسفكشن سلول‏هاي كبدي با منشا انساني به‏وسيله پلاسميد كد كننده ژنوم كامل ويروس هپاتيت B مي‏تواند منجر به توليد ويروس عفوني شود. در صورت راه‏اندازي و بهينه‏سازي كشت سلولي، تكثير ژنوم ويروس در اين سلول‏ها را مي‏توان با استفاده از PCR تشخيص داد، همچنين ترشح آنتي‏ژن سطحي ويروس به‏وسيله الايزا قابل اندازه‏گيري است. ژن‏هاي القا كننده اينترفرون در پاسخ به درمان ويروس هپاتيت B با داروي اينترفرون آلفا بيان مي‏شود، در نتيجه اندازه‏گيري اين ژن‏ها مي‏تواند در موارد عدم پاسخ‏دهي به اين دارو موثر باشد. در نتيجه در مطالعات دارويي علاوه بر تشخيص اثر ماده مورد نظر بر شاخص‏هاي ويروسي، با سنجش ژن‏هاي القا كننده اينترفرون مي‏توان اثر دارو را نيز در فعال‏سازي ايمني ذاتي عليه ويروس هپاتيت B بررسي كرد. مواد و روش‏ها: در اين مطالعه ترانسفكشن سلول‏هاي كبدي Huh-7 به‏وسيله پلاسميد pCH-9/3091 انجام شد و سپس بيان آنتي‏ژن سطحي هپاتيت B و همچنين توليد mRNA‏هاي ويروسي بررسي شد. علاوه بر اين، با استفاده از آغازگرهاي ژن‏هاي القا كننده اينترفرون، روش شناسايي آن‏ها راه‏اندازي و بهينه‏سازي شد. نتايج: سلول‏هاي Huh-7 از تكثير ويروس هپاتيت B حمايت مي‏كنند. انجام الايزا روي مايع رويي سلول‏ها بيشترين ميزان آنتي‏ژن سطحي هپاتيت B را در 72 ساعت پس از ترانسفكشن تاييد مي‏كند. با استفاده از آغازگرهايي كه براي نواحي S و pg/pC طراحي شده، رونويسي و تكثير ژنوم ويروس نشان داده شد. نتايج PCR با استفاده از آغازگرهاي ژن‏ القا كننده اينترفرون روي سلول‏هاي ترانسفكت شده با پلاسميد ويروسي نشان داد كه ممكن است ويروس هپاتيت B در بالا بردن ميزان ژن‏هاي القا كننده اينترفرون در سلول‏هاي Huh-7 نقشي نداشته باشد. نتيجه‏گيري: يافته‏ها نشان داد اين سيستم مي‏تواند راه حلي باشد براي مطالعه روي عملكرد ژنوم ويروس، آزمايش دارو‏ها و واكسن‏هاي جديد و همچنين بررسي مكانيسم‏هاي مقاومت‏هاي دارويي كه در حال حاضر پاسخ به داروهاي كنوني از جمله اينترفرون آلفا را با مشكل مواجه نموده است.

Objective: Despite availability of an effective vaccine against hepatitis B virus (HBV), the global prevalence of this virus infection has not diminished significantly. Contrary to numerous other human viruses, HBV does not have the ability to propagate in cell culture. However, infectious virus has been produced by transfection of human hepatoma cells with plasmids that contain full length HBV genome. Generation and optimization of appropriate cell culture systems can help us in demonstrating the quality of genome replication by PCR as well as expression of surface antigen secretion. Interferon stimulating genes (ISGs) are usually produced in response to interferon and can be determined as a measure of response to IFN-therapy. Therefore, in pharmacological studies, in addition to assessing the effects of a medicine on viral determinants of replication, its’ effects on stimulation of various ISGs, as indicators of innate immune responses, can be achieved. Methods: In this study, we transfected the Huh-7 hepatoma cell line with pCH-9/3091. HBsAg production and viral mRNA transcription were subsequently evaluated. In this system, by using ISGs-specific primers, the ISG mRNAs recognition method was optimized and utilized. Results: Huh-7 cells supported HBV replication. The peak HBsAg secretion was observed at 72 h post-transfection. By using designed primers for the S and pg/pC regions, transcription and genome replication of the virus was shown. RT-PCR results for ISG production by transfected cells showed no role for HBV in enhancement of ISGs levels in Huh-7 cells. Conclusion: The results indicated that this system can be used for functional studies of HBV-specific genes as well as assessment of the effects of new drugs or new vaccines. In addition, it may be used to study the mechanisms of drug resistance that have resulted in difficulties in response to HBV antivirals, including IFN-?.