بررسي ريخت‏شناسي و رشد سلول‏هاي اپيتليالي رنگدانه‏دار شبكيه انسان بر لايه‏اي نازك از آلژينات و تركيب آلژينات/ ژلاتين به عنوان بستر

Studying the Morphology and Growth of Human Retinal Pigment Epithelial Cells on a Thin Layer of Alginate and Alginate/Gelatin as a Culture Substrate

هدف: سلول‏هاي رنگدانه‏دار شبكيه انسان به صورت تك لايه در انتهاي شبكيه در ارتباط مستقيم با گيرنده‏هاي نوري قرار گرفته‏اند. در خيلي از بيماري‏ها اين سلول‏ها آسيب مي‏بينند. يكي از راه‏هاي درمان اين بيماري‏ها جايگزين كردن سلول‏هاي سالم به جاي سلول آسيب ديده است. به اين منظور از بستر‏هاي مختلفي براي كشت سلول استفاده شده كه در بررسي حاضر از بين اين بستر‏ها تركيبي از آلژينات و تركيبي از آلژينات/ ژلاتين براي مطالعه رشد اين سلول‏ها استفاده شد. مواد و روش‏ها: از آلژينات سديم محلول‏هاي 1 و 2 درصد در آب و DMEM/F12 تهيه و در هر خانه از ظرف‏هاي 6 خانه ريخته شد تا بستر يكنواخت يك ميلي‏متري تشكيل شد. سلول‏هاي اپيتليالي رنگدانه‏دار پاساژ 4 روي بستر كشت داده شدند و ريخت‏شناسي سلول‏ها بررسي شد. سلول‏ها به بستر آلژينات در DMEM/F12 نمي‏چسبند و اندر كنش مناسبي با بستر‏هاي آلژينات ندارند، به همين دليل از آلژينات و ژلاتين محلول‏هاي 1 درصد و 2 درصد در آب دوبار تقطير با نسبت‏هاي 20 به 80، 30 به 70، 40 به 60، 50 به 50، 60 به 40، 70 به 30، 80 به 20 تهيه شد و به هر خانه از ظرف 6 خانه ريخته شده تا بستري يك ميلي‏متري از آلژينات/ ژلاتين ايجاد شد.سلول‏ها بر سطح بستركشت داده شده و ويژگي‏هاي آن‏ها مطالعه شد. نتايج: سلول‏هاي رنگدانه‏اي شبكيه انسان روي بستر‏هاي آلژينات/ ژلاتين به صورت كلوني‏هايي چسبيده بودند. در همه بستر‏ها با نسبت‏هاي مختلف آلژينات/ ژلاتين سلول‏ها از غشا عبور كرده و تك لايه‏اي از سلول را در زير بستر تشكيل مي‏دهند. به جز بستر 2 درصد با نسبترآلژينات/ ژلاتين 20 به80 كه رشد سلول‏ها را بر سطح بستر نشان مي‏دهد. سلول‏ها تا مدت نامحدود بر بستر آلژينات/ ژلاتين زنده مي‏مانند و بعد از كشت دوباره بر سطح پليت ريخت‏شناسي اوليه خود را حفظ مي‏كردند. نتيجه‏گيري: بستر آلژينات/ ژلاتين 2 درصد با نسبت 20 به 80 براي كشت سلول‏هاي رنگدانه‏اي شبكيه انسان در مطالعات بعدي مناسب است.

Objective: Human retinal pigment epithelium (hRPE) is a cell monolayer located in the outer part of the retina that is in contact with photoreceptors. In many diseases RPE cells damage. One way for treating this disease is the implantation of intact instead of damaged cells. For this reason different types of substrates have been used for cell cultivation. This study has used alginate and a blend of alginate/gelatin (A/G) to study RPE cell growth. Methods: We prepared alginate solutions in concentrations of 1% and 2% (w/v) in water and DMEM/F12. The solutions were infused into each well of 6-well micro plates until a uniform culture substrate that had a 1 mm thickness was generated. Passage-4 hRPE cells were cultivated on the substrate and the cell characteristics studied. hRPE cells did not adhere to alginate in DMEM/F12 and did not exhibit interaction with alginate substrate. For this reason A/G solutions at concentrations of 1% and 2% (w/v) in water were prepared. We prepared A/G blends at weight ratios of: 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, and 80:20. These blends were infused into each well of 6-well plates until the appropriate 1 mm thickness of A/G was achieved. Isolated hRPE cells were cultured on synthetic substrate after which we studied the cellsʹ characteristics. Result: hRPE cell generated adhesive colonies on the A/G substrate. In all studied combinations of A/G, the diffused hRPE cells formed a monolayer under the substrate sheets. However the A/G 20:80 ratio had cell growth in the upper face of the substrate. hRPE survived indefinitely on A/G substrate. After the cells were re-cultured on polystyrene, they showed general morphological features of normal hRPE cells. Conclusion: The A/G blend at a 20:80 ratio was chosen to be used for future studies.