مقايسه الگوي PCR-RFLP با توالي‌يابي مستقيم ناحيه ITS نمدارهاي هيركاني

Comparison of PCR-RFLP pattern with sequencing analysis of the ITS region of Hyrcanainʹs Tilia

يكي از نشانگرهايي كه امروزه به عنوان DNA باركد براي گونه‌هاي گياهي پيشنهاد مي‌شود، تعيين توالي ناحيه هسته‌اي ITS است. از آنجا كه توالي‌يابي روشي پَر هزينه و نيازمند زمان طولاني است، اين مطالعه با به كارگيري روش PCR-RFLP قصد دارد تا ضمن مطالعه الگوي چند شكلي ناحيه ITS نمدارهاي هيركاني، نتايج اين دو روش (توالي‌يابي و PCR-RFLP) را با يكديگر مقايسه نمايد. به اين منظور با استفاده از هشت آنزيم برشي، الگوي الكتروفورزي 9 گونه نمدار جمع آوري شده از جنگل‌هاي هيركاني شمال ايران بررسي شد. نتايج نشان داد كه علاوه بر آنزيم EcoRI كه فاقد جايگاه برش در گياهان گل‌دار است، آنزيم BsrBI نيز در تمام توالي‌هاي نمدار مطالعه شده، بدون جايگاه برش است. هر دو روش گونه‌هاي مورد بررسي را در 9 گروه مجزا قرار داد و تنها تفاوت در گروه‌بندي گونه Tilia begonifolia Steven است كه يكي از پايه‌هاي آن در روش RFLP با گونه T. hyrcana Tabari and Colagar و در روش توالي‌يابي مستقيم با گونه T. rubra Rupr. در گروهي مجزا قرار گرفته است. همچنين، ميزان همسويي نسبتاً بالاي اين دو روش با استفاده از آزمون منتل نيز تاييد شد (57/0r=). تحليل PCoA نيز گوياي تمايز گونه‌هاي T. dasystyla، T. hyrcana و T. rubra و با منشا هيركاني از يكديگر است و تنها گونه T. begonifoila را نتوانسته است از اين گونه‌ها جدا نمايد. بنابراين، با توجه به نياز به صرف زمان و هزينه كمتر براي روش PCR-RFLP ناحيه ITS و نيز همسويي نسبتاً بالاي نتايج آن با روش توالي‌يابي مستقيم، اين روش به عنوان روشي مناسب، ساده و كم هزينه براي تبارشناسي گونه‌هاي گياهي پيشنهاد مي‌شود.

Abstract Sequencing of ITS region is one of the candidate markers as a DNA barcoding in Plants. Since sequencing technique is expensive and time consuming, we used PCR-RFLP technique and compared the result of these methods (PCR-RFLP and sequencing) to evaluate the efficiency of PCR RFLP technique in recognition of different species of Tilia from Hyrcanain forest. Electrophoresis pattern of ITS regions of nine species of Tilia were studied by eight restriction enzymes. Results indicated that the EcoRI and BsrBI did not have restriction site in the genus Tilia. Mantel test showed that the dendrogram derived from RFLP and cladogram indicated relatively high congruency (r=0.57). PCoA analysis recognized T. dasystyla, T. hyrcana and T. rubra from Hyrcanianʹs origin, but it could not separate T. begonifloia from the other hyrcanian species. In this respect, derived results were similar to sequencing one. In conclusion, with regard to less expensive and less time consuming PCR-RFLP technique and high similarity between its result with sequencing, we recommend this method as a simple and economical method with relatively high efficiency studding plant phylogeny. Key words: Internal Transcribed Spacer (ITS), Restriction fragment length polymorphism, Restriction enzyme, Phylogeny