بهينه‌سازي شرايط باززايي و تراريختي گياه كلزا، رقم‌هاي Hyola 308 و RGS003

Optimization of regeneration and transformation of canola Hyola 308 and RGS003 lines

هدف از اين تحقيق، بررسي غلظت مناسب BAP براي باززايي دو رقم مهم گياه كلزا و همچنين مطالعه تاثير زمان‌هاي پيش‌كشت، هم‌كشت و نيز غلظت‌هاي متفاوت استوسيرينگون (acetosyringon) بر تراريختي آنهاست. بدين منظور از دو رقم مهم كلزا Hyola 308) و (RGS003 كه در توليد بذرهاي مورد نياز كشور استفاده مي‌شود براي انتقال ژن گزارشگر GUS با واسطه آگروباكتريوم، استفاده شد. آزمايش‌ها در قالب طرح بلوك‌هاي كامل تصادفي با 5 تكرار براي هورمون بنزيل آمينو پورين (BAP) و 3 تكرار براي زمان‌هاي پيش‌كشت و هم‌كشت و استوسيرينگون انجام شد. نتايج به دست آمده نشان داد كه در غلظت 5/3 ميلي‌گرم در ليتر BAP، ميزان باززايي رقم Hyola 308 به 112 درصد و رقم RGS003 به 120 درصد افزايش يافت. تراريختي ارقام مورد استفاده كه روي محيط كانامايسين رشد كرده بودند با استفاده از آزمون PCR و بيان ژن توسط سنجش فعاليت GUS اثبات گرديد. نتايج مقايسه ميانگين اثرات متقابل سه‌گانه طول دوره پيش‌كشت، طول دوره هم‌كشت و غلظت‌هاي متفاوت استوسيرينگون بر ميزان تراريختي ارقام مورد مطالعه نشان داد كه بيشترين ميزان تراريختي در رقم Hyola 308 (33 درصد) در شرايط 100 ميكرومولار غلظت استوسيرينگون، و 48 ساعت براي زمان‌هاي پيش‌كشت و هم‌كشت، و در رقم RGS003 (38 درصد) در 50 ميكرومولار غلظت استوسيرينگون، زمان پيش‌كشت 48 ساعت و زمان هم‌كشتي 72 ساعت به دست آمد و هر دو نسبت به ساير تيمارها در گروه‌هاي آماري جداگانه قرار گرفتند. از شرايط بهينه به دست آمده براي انتقال ژن‌هاي هدف به اين ارقام مي‌توان استفاده نمود.

The objective of the study was to develop an efficient method for shoot regeneration and Agrobacterium-mediated gene transformation into Brasica napus cultivars, Hyola308 and RGS003. Different concentrations of benzylaminopurine (BAP) (3.5, 4, 4.5, 5, 5.5 and 6 mg/L) were evaluated for shoot regeneration of petiol cotyledonary explants. Also, the effect of preconditioning and co-cultivation periods and acetosyringone concentrations were studied on the Gus reporter gene transformation. The experimental design was factorial based on completely randomized design with 3-5 replications. Maximum shoot regeneration was obtained using 3.5 mg/L BAP with 112% for Hyola308 and 120% for RGS003 cultivars. The transformed plants were screened on kanamycin containing medium and the presence and the expression of the reporter gene were confirmed by PCR and Gus assay, respectively. The highest effect on transformation efficiency was observed through 48 h preconditioning and co-cultivation period and 100 µM acetosyringone for Hyola308 (33%), and 38 h preconditioning period, 72 h co-cultivation period and 50 µM acetosyringone for RGS003 (38%).