همسانه سازي، امتزاج و بررسي بيان كاست ژني ctB و N ترمينال ipaD در باكتري اشرشياكلي

Cloning, fusion and expression of ctB and N-terminal ipaD gene cassette in E. coli

چكيده زمينه و هدف: شيگلا ديسانتري يكي از عوامل اصلي بيماري اسهال در انسان بوده كه واكسني عليه آن وجود ندارد. يكي از مهم‌ترين فاكتورهاي بيماري‌زاي موجود در شيگلا، پروتيين IpaD است. همسانه سازيN ترمينال ژن ipaD به همراه ژنctB كه داراي نقش ادجوانتي و حاملي مي‌باشد به شكل يك واكسن نوتركيب مي‌تواند سبب تقويت پاسخ ايمني مخاطي شود. مواد و روش‎ها: در اين مطالعه تجربي، طراحي پرايمر براي ژن‌هاي ipaD و ctB بر مبناي طراحي انجام شده به منظور ساخت كاست ژني، صورت گرفت. واكنش PCR براي تكثير اين قطعات انجام و هر يك از قطعات تكثير شده درون وكتور pGEM-Teasy همسانه سازي شدند. هر دو وكتور توسط آنزيم‎هاي محدودالاثر Hind III و Xho I برش خورده و در نهايت ژن ipaD به ژن ctB ملحق گرديد. در ادامه كاست ژني ctB-ipaD و وكتور بياني pET28a(+) توسط آنزيم‎هاي محدودالاثر SalI و HindIII برش خورده و كاست ctB-ipaD در وكتور بياني زير همسانه سازي و بررسي بيان كاست ژني انجام گرفت. يافته‎ها: در اين تحقيق، N ترمينال ژن ipaD به عنوان يك آنتي ژن كانديد واكسن ژني به ناحيه C ترمينال ژنctB كه داراي نقش ادجوانتي و حاملي مي‌باشد، متصل گرديد. ژن‎هاي ممزوجي ctB-ipaD در وكتور بياني pET28a(+) توسط PCR و هضم به وسيله آنزيم‎هاي با اثر محدود تاييد شد. هم‎چنين پروتيين نوتركيب توليد شده به وسيله SDS-PAGE و لكه‎گذاري وسترن تاييد گرديد. نتيجه گيري: با توجه به مطالعات گذشته و مشابه، ايجاد كاست ژنيctB-ipaD و بررسي بيان آن، هدف مورد انتظار اين تحقيق بود. اميد مي‌رود با بيان پروتيين اين كاست ژني و در صورت توليد آنتي بادي مناسب بتوان به واكسن مناسب عليه شيگلا دست يافت. واژگان كليدي: ادجوانت، همسانه سازي، ژن ctB، فيوژن، ژن ipaD، شيگلوز.

Abstract Background: Having no effective vaccine, Shigella dysenteriae is of the main causes of diarrhea. IpaD protein is of the most important factors in high virulence of pathogenic shigella. Cloning of N-terminal ipaD genes along with ctB genes that possess adjuvant and carrier roles, as a recombinant vaccine, can enhance mucosal immune response. Materials and Methods: In an experimental study, primers of ctB and ipaD genes were designed based on gene cassette construction. PCR reactions were performed to propagate the fragments. Propagated fragments, then, were cloned into pGEM-Teasy vectors. Both vectors, then, were cut by restriction enzymes of HindIII and XhoI, and finally ipaD and ctB were fused together. In the next step, the ctB-ipaD gene cassette and expression vector of pET28a (+) were cut by SalI and HindIII restriction enzymes. Then, ctB-ipaD cassette was expresses in the expression vector. Results: In prest study, the N terminal of ipaD as a vaccine candidate antigen was genetically linked to the C terminal of ctB which possesses carrier and adjuvant potency. Fusion of ctB-ipaD in the expression vector pET28a (+) was confirmed by PCR and restriction enzymes digestion. The recombinant proteins produced then was confirmed by SDS-PAGE and Western blot. Conclusion: According to previous studies, production of ctB-ipaD cassette and its expression was the aim of this study. In hop for a vaccine against Shigella, protein expression of this gene cassette and production of an appropriate should be followed in future studies. Keywords: Adjuvant, Cloning, ctB gene, Fusion gene, ipaD gene, Shigellosis.