سيتوپلاسم اسيدي سبب كاهش فعاليت كانال پتاسيم استخراج شده از شبكه آندوپلاسمي هپاتوسيت هاي رت مي گردد

Cytoplasmic acidification reduces potassium channel activities in the endoplasmic reticulum of rat hepatocytes

مقدمه: اساساً pH داخل سلولي (pHi) تمام فعاليت هاي سلول را تنظيم مي كند. اما مشخص نيست كه كانال پتاسيم شبكه آندوپلاسمي(ER)چگونه به pHi پاسخ مي دهد. در اين مطالعه، اثر مستقيم pHi بر كانال پتاسيم ER مورد بررسي قرار گرفت. روش‌ ها: در اين مطالعه از روش الحاق كانال به داخل غشا دو لايه ليپيدي استفاده گرديد. ليپيد فسفاتيديل كولين از زرده تخم مرغ تازه استخراج گرديد. غشا بر روي منفذ µm 150 تشكيل گرديد. وزيكول هاي ER پس از هموژنيزه كردن و چند مرحله سانتريفوژ بدست آمد. تمام ثبت هاي بدست آمده از روش ثبت تك كانال با فركانس kHz 1 فيلتر شد و با سرعتkHz 10 نمونه برداري گرديد و توسط نرم افزار PClamp10 آناليز شد. از وسترن بلات براي تاييد خلوص نمونه استخراج شده استفاده گرديد. آناليز آماري بر اساس آناليز تك كانال عاري از نويزMarkov انجام گرديد. يافته ها: آنتي بادي هاي استفاده شده در وسترن بلات نشان داد كه نمونه هاي ER خالص بوده است. ثبت از كانال، حضور يك كانال پتاسيم با كنداكتانس pS596 را نشان داد كه توسط mM 2.5 ATP، گلي بن كلاميد µM 100 و تولبوتاميد µM 400 مهار گرديد. افزايش pHi به 8.2 اثري بر فعاليت كانال نداشت. كاهش pHi به 6.7 و 6.2 بترتيب باعث كاهش و مهار كامل فعاليت كانال گرديد. نتيجه گيري: اسيدي شدن داخل سلول فعاليت كانال پتاسيم ER را مهار مي كند. احتمالاً تنظيم مستقيم فعاليت كانال پتاسيم ER توسط pHiاهميت زيادي جهت درك ما در فرايند هوميوستاز ER دارد.

Introduction: Intracellular pH (pHi) regulates essentially all aspects of cellular activities. However, it is unknown how endoplasmic reticulum (ER) potassium channels sense pHi. In this study, we investigate the direct effects of pHi on ER potassium channels. Methods: We used channel incorporation into the bilayer lipid membrane method. L-a -phosphatidylcholine, a membrane lipid, was extracted from fresh egg yolk. Bilayer lipid membrane was formed in a 150 m diameter hole. Rough endoplasmic reticulum vesicles were obtained from the liver after homogenization and several centrifugations. All single channel recordings were filtered at 1 kHz and stored at a sampling rate of 10 kHz for offline analysis by PClamp10. The purity of cell fractions was confirmed by western blot using specific markers of mitochondria, plasma membrane, endoplasmic reticulum, and Golgi. The pH was measured with a pH meter (0.001 unit accuracy). Statistical analysis was performed based on Markov noise free single channel analysis. Results: Western blotting and antibodies directed against various cellular proteins revealed that ER fractions did not contain specific proteins of the other subcellular compartments. Single channel recordings revealed a 596 pS K+ channel, which was inhibited by 2.5 mM ATP, 100 µM glibenclamide and 400 µM tolbutamide. No effect of increasing pHi to 8.2 was found but decreasing pHi to below about 6.7 produced a marked inhibition of channel activity, with complete block being observed at pHi 6.2. Conclusion: Our results indicate that intracellular acidification inhibits ER K+ channel activities. The direct regulation of ER K+ channels by pHi has important implications for ER homeostasis.