تكثير، كلونينگ و بيان ژن bp26((omp28 Brucella melitensis بومي استان مركزي به منظور توليد پروتيين نو تركيب BP26

Amplification, cloning, and expression of Brucella melitensis bp26 gene isolated from Markazi province in‎ order to produce BP26 recombinant protein

چكيده زمينه و هدف: بروسلوز بيماري ناتوان كننده‎اي است كه هزينه گزافي را بر اقتصاد و اجتماع تحميل مي‎كند. بنابراين استفاده از بهترين، دقيق‎‎‎‎‎‎ترين و به صرفه‎ترين روش براي تشخيص اين بيماري ضروري مي‎باشد. عامل شايع بروسلوز در ايران بروسلا بوده و پروتيين BP26اين باكتري خاصيت آنتي ژنيسيته خوبي دارد. بنابراين هدف از اين تحقيق توليد پروتيين BP26 نوتركيب از باكتري بروسلا جهت استفاده در كيت تشخيص بروسلوز مي‎باشد. مواد و روش‎ها: در اين مطالعه بن?ادي - كاربردي، از باكتري كشت شده، تخليص DNA ژنوميك به روش پروتييناز K و فنل/كلرفرم انجام شد. سپس با توجه به اطلاعات توالي ژن bp26 Brucella melitensis موجود در بانك اطلاعات ژن، براي ژن مذكور پرايمر طراحي شده و واكنش زنجيره‌اي پليمراز راه‎اندازي، بهينه‎سازي و انجام شد. در ادامه محصول واكنش ابتدا در وكتور PTZ57R/T الحاق گرديد و پس از آن در وكتور pET-28a كلون گرديد. وكتور نو‎تركيب به ميزبان E. coli BL21(DE3) منتقل گرديد و پروتيين نوتركيب و با ستون كروماتو‎گرافي Ni-NTA عليه His tag تخليص گرديد. يافته‎ها: اندازه ژن تكثير شده با اندازه بخشي از ژن bp26 Brucella melitensis موجود در بانك اطلاعات ژن مطابقت داشت. ژن bp26 بدون القا با IPTG به ميزان كم بيان شده و با افزودن آن به غلظت 1 ميلي‎مولار به محيط كشت در ساعت سوم، حداكثر بيان مشاهده شد. نتيجه‎گيري: توليد پروتيين نوتركيب BP26 از باكتري مليتنسيس بومي استان مركزي با استفاده از ناقل پلاسميدي pET-28a امكان‎پذير گرديد. با توجه به اهميت اين پروتيين و به منظور بررسي‎‎هاي بيشتر در آينده در خصوص تهيه كيت تشخيص بروسلوز، امكان توليد آن در كشور فراهم شد. واژگان كليدي: بروسلا مليتنسيس، بروسلوزيس، پروتيين BP26، ژن bp26

Abstract Background: Brucellosis is a debilitative disease that imposes heavy costs on the economy and society. Therefore, using the most accurate and efficient method to diagnose this disease is essential. In Iran, Brucella melitensis is the common causative agent for brucellosis and BP26 protein of this bacterium has a good level of antigenicity. Thus, the aim of this study is to produce Brucella melitensis recombinant BP26 protein with a PET28a expression vector. Materials and Methods: In this applied-fundamental study, genomic DNA was isolated from bacterial culture through proteinase K (pK) and phenol/chlorophorm protocol. Then, two pairs of primers were designed based on the known sequence in the gene bank for amplification of Brucella melitensis bp26 gene and PCR reaction was set up and optimized. The PCR product was cloned first into PTZ57R/T vector and accessed on the PET28a vector and sequenced. The recombinant vector was transformed and expressed into E. coli BL21 (DE3). Then, the recombinant protein was purified with Ni-NTA column of chromatography against His tag. Results: The size of PCR product was in accordance with the part of bp26 gene size in the gene bank. The bp26 gene without adding IPTG had little expression and 3 hours after adding IPTG with a 1 Mm concentration to culture media, extreme expression was observed. Conclusion: The production of recombinant BP26 protein from isolated Brucella melitensis native to Markazi province was done. Noticing the importance of BP26 protein and its significance for future studies on providing brucellosis diagnosis kits, its production was made possible. Keywords: Brucella melitensis, brucellosis, bp26 gene, OMP28