همسانه سازي و بيان ژن دومن a-1 آنتي ژن حفاظتي باسيلوس آنتراسيس در باكتري اشرشيا كلي

Cloning and Expression of Bacillus anthracis Protective Antigen Domain a-1 in E. coli

سياه زخم (آنتراكس) يك بيماري مشترك بين انسان و دام است. عامل ايجاد كننده بيماري، باكتري باسيلوس آنتراسيس مي باشد و آنتي بادي دومن a-1 آنتي ژن حفاظت كننده 62 (PA) درصد از آنتي ژن‌هاي مربوط به آنتي ژن حفاظت كننده (PA) را شناسايي مي‌كند و بالاترين حضور اوليگو پپتيدهاي آن در واكسن هاي AVP مشاهده شده است. در اين مطالعه تجربي، توالي مورد نظر از پلاسميد pXOI با جايگاه هاي آنزيمي BamHI و XhoI تكثير و در وكتور، همسانه سازي گرديد و بعد از جداسازي به وكتور pET28a(+) زيرهمسانه سازي و به باكتري E. coli سويه BL21(DE3) تراريخت (ترانسفورم) شد. بيان ژن دومن a-1 (PA) تحت القاي IPTG انجام و بعد از تخليص پروتيين با استفاده از كروماتوگرافي تمايلي، آنتي ژن حاصل در چهار نوبت به موش هاي سوري تزريق شد. آنتي بادي پلي كلونال توليد شده در سرم موش ها اندازه گيري گرديد. دومن a-1 (PA) كلون شده در وكتور بياني pET28a(+) به وسيله PCR، آناليز آنزيمي و توالي يابي تاييد گرديد. همچنين پروتيين نوتركيب توليد شده به وسيله SDS-PAGE و لكه گذاري وسترن تاييد شد. سپس آنتي بادي توليد شده از سرم موش جداسازي و توسط تست الايزا تاييد گرديد. هدف اين مطالعه توليد آنتي ژن دومن a-1 آنتي ژن حفاظتي باسيلوس آنتراسيس در باكتري E. coli مي باشد. با توجه به شناسايي آنتي ژن (PA) بوسيله آنتي بادي دومن a-1 و پايداري و حضور اوليگو پپتيدهاي آن تا هفت سال و يا بيشتر در واكسن هاي AVP، مي‌توان از آن به صورت مجزا، تركيبي با ساير دومن هاي (PA)، و يا اجوان ها در طراحي واكسن براي بيماري سياه-زخم استفاده نمود.

Anthrax is a zoonotic disease in humans and animals. The disease is caused by Bacillus anthracis and the antibodies of domain a-1 protective antigen (PA) identify 62% of the antigens related to PA and most of their oligopeptides are observed in the AVP vaccines. In this experimental study, plasmid pXOI sequences with BamHI and XhoI enzymatic sites were amplified and cloned in the cloning vector and subcloned into the vector pET28a(+) and transformed into BL21(DE3) strain of E. coli after separation. The gene expression was performed by IPTG induction and after protein purification using affinity chromatography, the resulting antigen was injected into mice four times. Polyclonal antibody produced in the mouse serum was measured. Domain a-1 protective antigen cloned into the expression vector pET28a (+) was confirmed by PCR, enzyme analysis and sequencing. The produced recombinant protein was also confirmed by SDS-PAGE and western blot. Then, the produced antibodies were isolated from the mouse serum and confirmed by ELISA. The aim of this study was to generate antigen domain a-1 protective antigen of B. anthracis in E. coli. With regard to identification of antigen PA by the domain a-1 antibody and presence and stability of their oligopeptides for seven years or more in the AVP vaccines, it can be used in designing a vaccine for anthrax separately, in combination with the other domains (PA), or with adjuvants