مطالعه فيلوژنتيكي باكتري سودوموناس پوتيدا توليد كننده پرولين دهيدروژناز و آناليز بيوانفورماتيكي آنزيم جداسازي شده

Phylogenic Study of Proline Dehydrogenase Producing Pseudomonas putida Bacterium and Bioinformatics Analysis of Isolated Enzyme

فلاو آنزیم پرولین دهیدروژناز (EC 1.5.99.8) نقش مهمی را در زیست حسگرها و كیتهای غربالگری به منظور تشخیص بیماریهای متابولیك مرتبط با نقص پرولین ایفاء می نماید. هدف از این تحقیق، جداسازی و تعیین مشخصات میكروارگانیسم های تولید كننده آنزیمهای دخیل در متابولیسم پرولین از نمونه های خاك ایران بود. غربالگری آنزیم های تخریب كننده L-پرولین از نمونه های خاك در سه مرحله شامل تكنیك كشت غنی، كروماتوگرافی لایه نازك و سنجش فعالیت آنزیمی، انجام شد. میكروارگانیسم جداسازی شده توسط واكنشهای بیوشیمیایی، آنالیز ژنهای RNA ریبوزومی s16، 16S-23S rRNA Internal Transcribed Spacer (ITS) و رسم درخت فیلوژنتیكی تعیین مشخصات گردید. مطالعات كینتیكی بر روی آنزیم شناسایی شده انجام شد و ساختار سه بعدی آن توسط روشهای بیوانفورماتیكی، شبیه سازی گردید. در بین 150 میكروارگانیسم جداسازی شده از 30 نمونه خاك، تنها یك سویه باكتری، فعالیت قابل ملاحظه ای نسبت به اسید آمینه L-پرولین (U/ml10) از خود نشان داد. پارامترهای ثابت میكائیلیس-منتن و سرعت ماگزیمم به ترتیب 12/0 میلی مولار و 11/0 میلی مولار بر دقیقه محاسبه شدند. سویه باكتری با استفاده از آنالیز فیلوژنتیكی ژنهای RNA ریبوزومی s16 و ITS به عنوان Biotype جدیدی از سودوموناس پوتیدا شناسایی شد. ساختاز سه بعدی شبیه سازی شده از آنزیم مذكور نیز قرار داشتن پرولین دهیدروژناز جداسازی شده در آنزیمهای خانواده سودوموناس پوتیداها را تایید نمود. این تحقیق اولین گزارش از تولید پرولین دهیدروژناز توسط باكتری سودوموناس پوتیدا جداسازی شده از نمونه خاك می باشد.

Proline dehydrogenase falvoenzyme (ProDH; EC 1.5.99.8) plays an important role in the biosensors and diagnostic kits for the diagnosis of proline related metabolic disorders. The purpose of this research was to isolate and characterize proline metabolizing enzymes producing microorganisms from Iranian soil samples. Isolation and screening of L-proline degradative enzymes from soil samples was carried out in three steps employing enrichment culture technique, thin layer chromatography (TLC) and enzyme activity assay. The isolate was characterized by biochemical reactions, 16S rRNA gene analysis and 16S-23S rRNA Internal Transcribed Spacer (ITS) sequencing. Kinetic studies were performed and 3-D structure of the enzyme of interest was predicted through bioinformatics methods. Among the 150 soil isolates recovered from 30 samples, only one strain displayed the highest enzyme activity toward L-proline (10 U/ml) than others. The Km and Vmax values were calculated as 0.12 mM and 0.11 mM/min. The strain was characterized as a new biotype of Pseudomonas putida using phylogenetic analysis of 16s rRNA and 16S-23S rRNA ITS. The predicted 3-D structure of target enzyme also confirmed the similarity of isolated ProDH to the family of P. putida enzymes. This is the first report concerning the ProDH production by a P. putida bacterium isolated from soil sample.