توليد و تخليص نواحي آنزيمي هيالورونيداز استرپتوكوك در باكتري

Production and purification of enzymatic region of streptococcal Hyaluronidase in E.coli

چكيده زمينه و هدف: استرپتوكوكوس پيوژنز آنزيم هيالورونيداز خارج سلولي توليد مي‌كند كه با انتشار ارگانيسم در طول عفونت ارتباط مستقيم دارد. آنزيم هيالورونيداز قادر به تجزيه هيالورونيك اسيد يا سيمان بين بافتي مي‌باشد. از اين آنزيم ميتوان در درمان سرطان‌ها استفاده نمود. هدف از تحقيق حاضر كلون كردن و بيان توالي نوكليوتيدي كه در فعاليت آنزيمي هيالورونيداز نقش دارد، مي‌باشد. مواد و روش‌ها: ابتدا توالي نوكليوتيدي از ژن هيالورونيداز كه در فعاليت آنزيمي دخيل است، شناسايي گرديد. سپس ناحيه مورد نظر توسط PCR تكثير يافت. قطعه تكثير يافته در وكتور pET32a الحاق شد. پلاسميد نوتركيب به سلول E.coli BL21-DE3-plysS ترانسفورم گرديد. سپس بيان ژن به وسيله IPTG القا گرديد. پروتيين توليد شده با روش كروماتوگرافي تمايلي و با استفاده از كيت Ni-NTA تخليص گرديد. براي تاييد پروتيين توليد شده از تست وسترن بلات استفاده گرديد. يافته‌ها: ترادف نوكليوتيدي ژن تكثير شده با ژن هيالورونيداز استرپتوكوكوس پيوژن يكسان بود. غلظت پروتيين توليدشده و خالص شده با كيت Ni- NTA برابر 500 ميلي‌گرم در ميلي‌ليتر بود. سرم بيماران مبتلا به عفونت‌هاي استرپتوكوكي در روش وسترن بلات با پروتيين توليد شده واكنش داد. نتيجه‌گيري: به طور كلي توليد نواحي آنزيمي هيالورونيداز استرپتوكوك پيوژنز در باكتري اشريشياكلي امكان پذير مي‌باشد. پروتيين توليد شده خاصيت آنتي ژنيك خود را به خوبي حفظ مي‌كند. با توجه به نياز داخلي كشور و هم‌چنين بازدهي كم توليد و بيماري زا بودن استرپتوكوك‌ها توليد اين محصول به صورت نوتركيب امكان پذير است. واژگان كليدي: كلونينگ، بيان ژن، هيالورونيداز، استرپتوكوك پيوژنز

Abstract Background: Streptococcus pyogenes produce extracellular hyaluronidase enzyme which is directly associated with the spreading of the organism during infection. Hyaluronidase enzyme is able to break hyaluronic acid or interstitial cement. This enzyme might be used in cancer treatment.The objective of the present study was to clone and express the nucleotide sequence of this enzyme which is involved in hyaluronidase enzymatic activity. Materials and Methods: The enzymatic region of hyaluronidase gene was detected by bioinformatics methods. The polymerase chain reaction method was used to amplify the region. The amplified product was cloned into the expression vector pET32a. E. coli BL21 (DE3) pLYsS was transformed with recombinant plasmids. Then gene expression was induced by IPTG. The expressed protein was purified successfully via affinity chromatography by NiNTA kit. The integrity of the product was confirmed by western-blot analysis. Results: The nucleotide sequence of amplified gene was consistent with the streptocuccal hyaluronidase gene. The concentration of recombinant protein calculated to 500 mg purified protein per liter. The enzymatic region of recombinant protein from Streptococcus pyogenes was recognized by all five patient’s sera with Streptococcus infection. Conclusion: In general, it is possible to produce the enzymatic regions of the Streptococcus pyogenes hyaluronidase in Escherichia coli. The antigenic property of the produced protein is well retained. Considering the productʹs domestic demand and also low efficiency of production and pathogenicity of Streptococcus species, it is possible to produce it as recombinant product. Keywords: Cloning, Gene Expression, Hyaluronidase, Streptococcus pyogenes