ساخت پلاسميد pDS132::?icsA جهت حذف هدفمند نواحي از ژن icsA به منظور توليد واكسن زنده تخفيف حدت يافته شيگلا

Construction of pDS132::∆icsA for targeted deletion of a region of icsA gene in order to generate a live attenuated Shigella vaccine

چكيده زمينه و هدف: واكسن‌هاي زنده تخفيف حدت يافته شيگلا پاسخ‌هاي اميدبخشي در ايجاد ايمني حفاظتي در آزمايشات باليني بر روي انسان را نشان داده‌اند. هدف از اين تحقيق طراحي و ساخت پلاسميد pDS132::?icsA به عنوان يك ناقل انتحاري براي حذف هدفمند بخشي از ژن icsA در شيگلا مي‌باشد. مواد و روش‌ها: در اين مطالعه تجربي، گونه و سرووار شيگلاي جدا شده از نمونه‌هاي كودكان مبتلا به اسهال، در بيمارستان‌هاي فيروزآبادي و ميلاد تهران، با استفاده از آزمايش سرم شناسي و واكنش زنجيره‌اي پليمراز مورد تاييد قرار گرفت. آغازگرهاي شناسايي ژن icsA طراحي و سپس در حامل pGEM-5zf همسان سازي و تعيين توالي گرديد. بر اساس نقشه برش آنزيمي ژن icsA، 1751 جفت باز از ژن icsA با استفاده از آنزيم محدودكننده Hinc? حذف و ژن جهش يافته ?icsA به طور موفقيت آميزي ايجاد گرديد. حامل pGEM?icsA با استفاده از آنزيم‌هاي SphI و SalI هضم گرديد و سپس در حامل انتحاري (pSD132) همسانه سازي شد. صحت فرآيند با آزمايش‌هاي فنوتيپي و ژنوتيپي تاييد گرديد. يافته‌ها: سويه شيگلا ديسانتري تيپ1 با آزمايش سرولوژيكي و PCR تاييد گرديد. توالي ژن icsA سويه بومي با سويه‌هاي ثبت شده در بانك ژني يكسان بود. حامل انتحاري pDS132::?icsA با در بر داشتن 1484 جفت باز، مشتق شده از ژن icsA مي تواند به عنوان يك ناقل انتحاري اختصاصي در ايجاد تداخل در ژن icsA به كار رود. نتيجه‌گيري: استفاده از سيستم‌هاي انتحاري ايجاد جهش هدف مند را تسهيل و در مقايسه با ساير تكنيك‌هاي اوليه مانند پاساژ متوالي روش اختصاصي و موثرتري مي‌باشد. واژگان كليدي: تبادل آللي، ژن icsA ، شيگلا ديسانتري تيپ 1، شيگلوز، ناقل انتحاري

Abstract Background: Live attenuated Shigella vaccines have shown promise in inducing protective immune responses in human clinical trials. The aim of this study was to design and construct pDS132::?icsA as a suicide plasmid for targeted deletion of a region of icsA gene in Shigella. Materials and Methods: In this experimental study, species and serotypes of Shigella isolated from diarrhea samples of children at Firozabadi and Milad Hospitals of Tehran were confirmed by using serological and PCR tests. Identification primers of icsA gene were designed and then cloned to the pGEM-5zf vector and sequenced. According to icsA restriction enzyme map, 1751 bp of icsA gene was deleted by Hinc? restriction enzyme and the ?icsA was constructed successfully. The pGEM?icsA vector was digested by use of SphI and SalI enzymes and was then cloned to a suicide vector (pSD132). Precision of the process was confirmed by phenotype and genotype tests. Results: The Shigella dysenteriae type 1 strain was verified by serological tests and PCR. Sequence of the icsA gene in the native strain was identical to the strains submitted in the gene-bank database. Since the pDS132::?icsA contains 1484 bp derived from icsA gene, it can be used to disrupt icsA gene as a specific suicide vector. Conclusion: Application of suicide systems facilitated mutant construction in more specific and effective methods in comparison with the other primary techniques such as serial passage. Keywords: Allelic exchange, IcsA, Shigella dysenteriae type 1, Shigellosis, Suicide vector