جداسازي و كلونينگ ژن نورآمينيداز ويروس آنفلوانزا A (H1N1 سويهNew Caledonia ) در وكتور بكميد به منظور ساخت باكيولوويروس نوتركيب

Construction of a recombinant bacmid DNA in order to express Neuraminidase gene of influenza virus H1N1

چكيده زمينه و هدف: در سال‎هاي اخير ويروس آنفلوانزا باعث عفونت‎هاي متوسط تا شديد با ميزان پراكندگي وسيع در سرتاسر دنيا شده است. بر اين اساس، واكسن آنفلوانزايي كه تنها يك دوز آن محافظت ايجاد نمايد هنوز در دسترس نيست. بنابراين، تهيه يك واكسن عمومي و فراگير بر اساس ذرات شبه ويروسي غيرتكثيري ايده‎ال مي‎باشد. در تحقيق حاضر يكي از سازه‎هاي مولكولي براي ساخت اين ذرات مد نظر قرار گرفته است. مواد و روش‎ها: در اين مطالعه تجربي، رده سلولي MDCK براي تكثير ويروس آنفلوانزاي انساني تيپ A/New Caledonia H1N1 استفاده شد. سپس كل RNA سلول، استخراج شده و با استفاده از پرايمر random hexamer به عنوان پرايمر عمومي cDNA ساخته شد. قطعه (1413 bp)NA با روش PCR تكثير داده شد و در وكتور pBluescript SK كلون شد. سپس قطعه نورآمينيداز در پلاسميد pFastBac11 از طريق محل‎هاي برش آنزيمي SalI و XhoI ساب‎كلون گرديده و صحت آن با توالي‎يابي دو طرفه مورد تاييد قرار گرفت. وكتور pFastBac1NA به ميزبان E.coli DH10Bac كه حاوي بكميد و پلاسميد كمكي بود منتقل شد تا بكميد نوتركيب نورآمينيداز ساخته شود. يافته‎ها: بكميد نوتركيب نورآمينيداز با روش نوتركيبي هومولوگ بين pFastBac1NA و بكميد به وجود آمد. اين محصول با استفاده از PCR و پرايمرهاي اختصاصي نورآمينيداز و عمومي M13 تاييد گرديد. نتيجه‎گيري: از بكميد نوتركيب ساخته شده در اين مطالعه به همراه بكميدهاي نوتركيب، حاوي ساير ژن‎هاي ساختماني ويروس، مي‎توان براي ساخت ذرات شبه ويروسي آنفلوانزا استفاده نمود و يا پروتيين حاصل از بيان اين سازه را در سلول‎هاي حشرات خالص نموده و در تحقيقات واكسن شناسي استفاده نمود. واژگان كليدي: ويروس آنفلوانزا، نورآمينيداز، بكميد نوتركيب، ذرات شبه ويروسي

Abstract Background: In recent years Influenza viruses have caused widely spread moderate to severe infection in all around the world and there is no Influenza vaccine which can protect people only with one dose injection till now. Therefore , producing a universal vaccine based on virus like particle (VLP) could be ideal. In this study one of the molecular structures was considered for VLP based Influenza vaccine. Materials and Methods: In this experimental study, the human influenza virus (A /New Caledonia 20/1999/ (H1N1)) was propagated in MDCK cell culture. Viral RNA was extracted using RNX-plus solution. Complementary DNA synthesis was carried out using uni-12 primer and random hexamer as specific and general primers, respectively. Neuraminidase open reading frame (1413-bp) was amplified by PCR and cloned into pBlue-script SK. Neuraminidase coding frame sub cloned into pFastBac11 plasmid through SalI/XhoI sites. After verification of cloned Neuraminidase by restriction analysis, it was subjected to automated sequencing bi-directionally. The recombinant pFastBac Neuraminidase vector was transformed to E.coli DH10Bac cells which harbor bacmid DNA and helper plasmid to create Neuraminidase recombinant bacmid. Results: Neuraminidase recombinant bacmid was created by homologous recombination between pFastBacNA and bacmid and was verified by PCR using Neuraminidase specific and M13 universal primers. Conclusion: Recombinant baculovirus expressing Neuraminidase gene can be also used with other individual recombinant baculoviruses expressing HA and M1 genes in production of influenza VLPs or proteins resulting from this structure could be purified in specific insects for vaccine research studies. Keywords: Genetic vector, Influenza vaccine, Neuraminidase, Recombinant baculovirus, Virus like particles