همسانه‌سازي و بيان ژن‌هاي ممزوجي دومن - a1 آنتي‌ژن حفاظتي با سيلوس آنتراسيس و زيرواحد B سم شيگلا در باكتري E. coli

Cloning and Expression of Fusion Genes of Domain A-1 Protective Antigen of Bacillus Anthracis and Shigella Enterotoxin B Subunit (Stxb) In E. Coil

مقدمه: يكی از فاكتورهای بيماری‌زای اصلی در شيگلا ديسانتری تيپ 1 و E. coli O157:H7، انتروتوكسين شيگلايا (StxB) بوده كه خاصيت ايمنی زايی، اجوانتی و دليوری آن به اثبات رسيده است. سياه‌زخم (آنتراكس) يك بيماری مشترك بين انسان و دام بوده و آنتی‌بادی دومن - a1 آنتی‌ژن حفاظت‌كننده باسيلوس آنتراسيس 62 درصد آنتی‌ژن‌های مربوط به آنتی‌ژن حفاظت‌كننده (PA) باكتری باسيلوس آنتراسيس را شناسايی می‌كند. هدف ايـن مطالعه بيان ممـزوجی دومن - a1 آنتی‌ژن حفاظتی باسيلوس آنتراسيس (PA20) با زيرواحد B سم شيگلا (STxB) در باكتری E. coli می‌باشد. روش بررسی: در اين مطالعه تجربی، طراحی پرايمر برای ژن‌ pa20 به منظور جايگزينی آن در كاست ژنی ipaD-stxBصورت گرفت. واكنش PCR برای تكثير اين قطعه انجام و قطعه تكثير شده به درون pGEM-Teasy vector همسانه سازی شد. ژن‌ pa20 توسط آنزيم‌های محدودالاثر NdeI و SalI برش خورده و در نهايت ژن‌ pa20 با ژن stxB ممزوج شد. وكتور pET28a(+) حاوی كاست ژنی pa20-stxB ساخته شده به باكتری E. coli سويه BL21(DE3) تراريخت‌ و بررسی بيان كاست ژنی انجام شد. نتايج: ژن‌های ممزوجی pa20-stxB در وكتور بيانی pET28a(+) توسط PCR، هضم آنزيمی و با توالی يابی تأييد شد. همچنين پروتئين نوتركيب توليد شده به وسيله SDS-PAGE و لكه‌گذاری وسترن تاييد گرديد. نتيجه‌گيری: با توجه به شناسايی آنتی ژن (PA) به وسيله آنتی‌بادی PA20 و پايداری بالای آن در واكسن‌های AVA و خاصيت القای آپاپتوز آن و خاصيت ايمنی‌زايی، اجوانتی و دليوری پروتئين STxB و بيان زياد Gb3 در سطح سلول‌های سرطانی انسان اين آنتی‌ژن به عنوان يك آنتی‌سرطان و كانديد واكسن نوتركيب عليه انواع شيگلا، اشريشياكلی و باسيلوس آنتراسيس می‌تواند مطرح باشد.

Introduction: Shigella enterotoxin(STxB) is one of the major virulent factors in Shigella dysenteriae type 1 and E. coli O157:H7, which its immunogenicity, adjuvant and delivery characteristic have been proven. Anthrax is a common disease in humans and animals and identifies domain a-1 antibodies of protective antigen(PA) which is 62% of the PA antigens of Bacillus anthracis. Therefore, the purpose of this study was to investigate the expression of recombinant protein domain a-1 protective antigen(PA20) of Bacillus anthracis with Shigella enterotoxin B subunit(STxB) in E. coli. Methods: In this experimental study, primers of pa 20 gene were designed for replacement in stxB-ipaD gene cassette. PCR was performed in order to amplify the fragment and the amplified fragments were cloned into pGEM-Teasy vector. NdeI and SalI restriction enzymes cut pa20 genes and finally the genes pa20 were fused with genes stxB. PET28a (+) Vector containing the gene cassette pa20-stxB was transformed into E. coli strain BL21(DE3) and expression of gene cassette was studied. Results: pa20-stxB fused genes were confirmed in the expression vector pET28a(+) by PCR, enzyme digestion and Sequencing. The produced recombinant proteins were confirmed by SDS-PAGE and Western blotting. Conclusion: The findings of the current study revealed that this antigen can be raised as an anti-cancer and recombinant vaccine candidate against types of Shigella, Escherichia coli and Bacillus anthracis which can be due to such factors as identification of antigen(PA) by antibody PA20, its apoptosis induction properties, property of immunogenicity, adjuvant and delivery of STxB protein and high expression levels of Gb3 in human cancer cells.