تاثير هم‏زمان -Azacytidin5 و DMSO در القاي تمايز كارديوميوسيت‏ها از سلول‏هاي كارسينوماي جنيني P19 در شرايط آزمايشگاهي

The Concurrent Effect of 5-Azacytidin and DMSO on In Vitro Differentiation Induction of Cardiomyocytes from Embryonic Carcinoma cells P19

هدف: در مطالعه حاضر توانايي تمايز سلول‏هاي كارسينوماي جنيني P19در حضور هم‏زمان -Azacytidin5 و DMSO به كارديوميوسيت‏ها مورد ارزيابي قرار گرفت. مواد و روش‏ها: جهت تمايز سلول‏هاي P19، اجسام شبه جنيني (Embryoid Bodies,EBs) به‏روش قطرات آويزان طي 2 روز تشكيل شدند. سپسEBs به‏مدت 10 روز تحت القاي 2 ميكرومولار (5-Aza group) 5-Azacytidin، (DMSO group) DMSO، 5/0 درصد و تركيب DMSO و 5-Azacytidin (Aza+DM group) قرار گرفتند. طي تمايز تعداد ضربان در دقيقه هر دو روز يكبار در گروه‏هاي مختلف به‏وسيله ميكروسكوپ معكوس شمارش شدند. بيان ژن‏هاي نظير (?-Myosin Heavy Chain, ?-MHC)، (Myosin Light Chain, MLC) و (Connexin-43) به‏وسيله RT-PCR در روز دهم پس از القا بررسي شدند. جهت بيان پروتيين F-actin از ايمونوسيتوشيمي استفاده شد. نتايج: تغييرات مورفولوژيكي زيادي در كارديوميوسيت‏هاي مشتق شده از P19 به‏ويژه در گروه Aza+DM group ايجاد شد به‏طوري‏كه افزايش مشخصي در اندازه سيتوپلاسم و زوايد سيتوپلاسمي آن‏ها ديده شد و به‏تدريج شاخه شاخه شدن زوايدشان افزايش يافت و با سلول‏هاي مجاور ارتباط برقرار كردند. نتايج شمارش روزانه تعداد ضربان در دقيقه در تمامي گروهها از روز 2+2 مشاهده شده و تا روز 8+2 بتدريج افزايش يافته است. در سلول‏هاي P19 كه تحت القاي هم‏زمان DMSO و 5-Aza بودند ژن‏هاي MLC و ?-MHC بيان شدند. كارديوميوسيت‏هاي Aza+DM group پروتيين F-actin را بيان كردند در حالي‏كه اين پروتيين در ساير گروه‏ها مشاهد نشد. نتيجه گيري: كاربرد هم‏زمان تركيبات DMSO و 5-Azacytidin موجب بهينه سازي محيط كشت تمايزي كارديوميوسيت‏ها از سلول‏هاي P19 مي‏گردد.

Aim: In current study capability of differentiation of embryonic carcinoma cells P19 to cardiomyocyte through inducing effects of DMSO and 5-Azacytidin individually or in combinative form in laboratory condition were examined. Material and Methods: In order to differentiate induction of P19, Embryoid Bodies (EBs) formed through hanging drops method during two days. Then EBs have induced by 2 ?M of 5-Azacytidin (5-Aza group), 0/5% DMSO (DMSO group) or both 5-Azacytidin and DMSO (Aza+DM Group) during ten more days. During differentiation beating number per minute counted every two days in all groups by invert Microscopy. Gene expression such as: ?-Myosin Heavy Chain (?-MHC) and Myosin Light Chain (MLC) and Connexin-43 have examined by RT-PCR in last day. To more accuracy, F-actin protein expression also illustrated through immunocytochemistry method. Results: Morphological changes in differentiated cardiomyocytes derived from P19 illustrated in all groups. However the most changes such as significant increasing in size and number of process, their branches and attachment between branches happened in Aza+DM group. Daily beating counter per minute revealed increasing in beating number from 2+2 to 2+8 in all groups. RT-PCR analysis also revealed expression of both ?-MHC and MLC in Aza+DM Group. However, F-action has expressed only in Aza+DM group. Conclusion: The Results have shown combination of two 5-Azacytidin and DMSO inducer caused effective cell culture differentiate of P19 to cardiomyocyte. Keywords: P19 Cells, Cardiomyocytes, 5-Azacytidin, DMSO