بكارگيري روش HRM در شناسايي و تفريق جدايه‌هاي ايراني ويروس بيماري نيوكاسل از سويه‌هاي واكسينال

براي كنترل همه‌گيري‌ها لازم است تا حضور ويروس‌هاي حاد از واكسن در كمترين زمان ممكن و با بيشترين دقت تشخيص داده شود. هدف از اين مطالعه، بكارگيري روش HRM (High-Resolution Melting-Curve Analysis) در شناسايي و تفريق جدايه‌هاي بومي ويروس بيماري نيوكاسل از سويه‌هاي واكسن بود. در اين مطالعه 5 جدايه حادNDV همراه با 6 نمونه‌ از واكسن‌هاي نيوكاسل موجود در بازار ايران مورد استفاده قرار گرفتند. بر اساس توالي نوكليوتيدي ژن F، 8 جفت پرايمر ( H–A ) براي آناليز HRM طراحي و ساخته شدند. در مرحله نخست 2 ويروس واكسن و يك ويروس حاد با هر 8 جفت پرايمر آناليز شدند. بر اساس نتايج حاصله، در مرحله بعد 3 جفت پرايمر از بين آنها انتخاب و تمام ويروسها مورد بررسي قرار گرفتند. با استفاده از نرم‌افزار، الگوهاي بدست آمده از ويروس‌هاي وحشي با الگوهاي حاصل از واكسن مقايسه شدند. با استفاده از جفت پرايمرهاي A، B، C، F و H دماي ذوب سويه‌هاي واكسن بالاتر از جدايه‌هاي حاد به دست آمد، اما با پرايمرهاي D، E و G اين حالت ديده نشد. بر اساس آناليز منحني‌هاي HRM در اين مطالعه، جفت پرايمرهاي B و H توانستند بهتر از سايرجفت پرايمرها سويه‌هاي واكسن را از يكديگر و از جدايه حاد تفكيك كنند. براساس يافته‌هاي حاصل از اين مطالعه مي‌توان نتيجه گرفت كه با استفاده از آناليز HRM و انتخاب پرايمرهاي مناسب مي‌توان در مدت زمان كوتاه و با دقت بالا در مقايسه با ساير روش‌هاي رايج قبلي نظير انجام آزمايش‌هاي تعيين شاخص‌هاي بيماري‌زايي، آزمون RT-PCR و تعيين توالي نوكليوتيدي اقدام به تفكيك و تعيين حدت ويروس‌هاي نيوكاسل و تشخيص ويروس‌هاي حاد از ويروس‌هاي واكسن كرد.

To control of outbreaks caused Newcastle disease, it is necessary to distinguish virulent viruses from vaccine strains, in minimum possible time and with high accuracy. The aim of this study was using High-Resolution Melting-Curve Analysis (HRM) for detection and differentiation of Iranian Newcastle disease virus (NDVs) isolates from vaccine strains. In this study, 5 virulent isolates along with 2 vaccine strains, including B1 and Lasota were used. Based on the nucleotide sequence of F gene, 8 primers (A - H) were designed for the analysis of HRM. At the first stage, one virulent and 2 vaccine virus was analyzed by 8 primer pairs. Based on the preliminary results of both RT-PCR HRM, 3 sets of the primers have been selected for final testing of the samples. The patterns obtained from wild viruses were compared with vaccine group. The melting temperatures for vaccine strains were higher than virulent isolates by A, B, C, F and H primer pairs; despite D, E and G. In this study, B and H primer pairs could separate vaccine strains from each other and from virulent isolates, better than other primers. Based on these results, HRM analysis and correct primer selection can determinate and differentiate virulent NDVs from vaccine strains. This technique is able to do this in short time and with high accuracy in comparison with previous conventional approaches such as pathogenicity indices tests, RT-PCR and nucleotide sequencing.