بررسي بيان ژن Tsga10 در فرايند تمايز سلول‌هاي بنيادي جنيني موشي به سلول‌هاي ژرمينال در محيط آزمايشگاهي

Expression analysis of Tsga10 during in vitro differentiation of germ cells from mouse embryonic stem cell

زمينه و هدف: توليد سلول‌های ژرمينال در محيط آزمايشگاهی می‌تواند نويد‌دهنده درمان تعدادی از موارد ناباروری مردان باشد. مطالعه حاضر ضمن بررسی فرايند تمايز سلول‌های بنيادی جنينی موش به سلول‌های ژرمينال، بيان ژن Testis specific 10 (Tsga10) را نيز برای اولين‌بار در اين فرايند مورد بررسی قرار داده است. روش بررسی: اين مطالعه يك مطالعه آزمايشگاهی (In vitro) است كه در گروه ژنتيك پزشكی دانشگاه علوم پزشكی تهران از بهمن 1390 تا اسفند 1391 انجام شده است. سلول‌های بنيادی جنينی موشی توسط رتينوييك اسيد (Retinoic acid, RA) به سمت سلول‌های ژرمينال القا شدند. در نمونه سلول‌های در حال تمايز روزهای هفت، 12 و 25 بيان سه گروه از ژن‌های Pre-meiotic، Meiotic و Post-meiotic با استفاده از Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) بررسی شد. برای بررسی بيان ژن Tsga10 به‌عنوان يك ژن اختصاصی اسپرماتوژنز، Real-time RT-PCR انجام گرفت و نتايج تفسير گرديد. حضور پروتيين TSGA10 در سلول‌های تمايز‌يافته با وسترن بلاتينگ و ايمونوسايتوشيمی (Immunocytochemistry) تاييد شد. يافته‌ها: در مراحل اوليه روند تمايز (روز 12) ميزان نسبی بيان Tsga10 به 32/0 مقدار پايه آن در سلول‌های غير تمايز‌يافته كاهش يافت. پس از بيان ژن‌های Post-meiotic (روز 25) ميزان نسبی بيان Tsga10 به‌مقدار 2/2 افزايش يافت. همچنين ميزان بيان نسبی Tsga10 در بيضه موش پنج، 10 و 15 روزه به‌ترتيب 125، 150 و 170 بود. اين ميزان در بيضه موش بالغ برابر 1650 برآورد شد. نتيجه‌گيری: در طی فرايند تمايز سلول‌های بنيادی جنينی، بيان Tsga10 پس از بيان ژن‌های Post-meiotic نسبت به مرحله Meiotic حدود 6/6 برابر افزايش داشت. افزايش بيان Tsga10 در طی عبور از مرحله Meiotic به Post-meiotic، نقش اين ژن و محصول پروتيين آن‌را در مراحل تكامل سلول‌های ژرمينال نشان می‌دهد.

Background: About 15% of couples have fertility problems and male factor in fertility accounts for half of the cases. In vitro generation of germ cells introduces a novel approach to male infertility and provides an effective system in gene tracking studies, however many aspects of this process have remained unclear. We aimed to promote mouse embryonic stem cells (mESCs) differentiation into germ cells and evaluate its effectiveness with tracking the expression of the Testis specific 10 (Tsga10) during this process. Methods: This is an in vitro study that was performed in department of Medical Genetics in Tehran University of Medical Sciences from February 2012 to March 2013. Mouse embryonic stem cells were cultured on mouse embryonic fibroblast as feeder layer. Then mESCs were differentiated into germ cells in the presence of Retinoic Acid. Based on developmental schedule of the postnatal testis, samples were taken on the 7th, 12th and 25th days of the culture and were subjected to expression analysis of a panel of germ cell specific genes (Stra8 as pre-meiotic, Dazl and Sycp3‌ as meiotic and Protamin1 and Spata19 as Post-meiotic). Expression of Testis Specific Gene 10 (Tsga10) at RNA and protein levels was then analyzed. Results: It was shown that transition of embryonic stem cells from mitosis to meiosis occurred between 7th and 12th days of mESC culture and post-meiotic gene expression did not occur until 25th day of the culture. Results showed low level of Tsga10 expression in undifferentiated stem cells. During transition from meiotic to post-meiotic phase, Tsga10 expression increased in 6.6 folds. This finding is in concordance with in vivo changes during transition from pre-pubertal to pubertal stage. Localization of processed and unprocessed form of the related protein was similar to those in vivo as well. Conclusion: Expression pattern of Tsga10, as a gene with critical function in spermatogenesis, is similar during in vitro and in vivo germ cell generation. The results suggest that in vitro derived germ cells could be a trusted model to study genes behavior during spermatogenesis.