مرکز منطقه ای اطلاع رساني علوم و فناوري - همسانه سازي و بيان ژن كد كننده آلفا آميلاز باسيلوس ليكنيفورميس و تعيين ويژگي هاي بيوشيميايي آنزيم نوتركيب

چكيده فارسي :

سابقه و هدف: آلفا آميلاز يك اندونوكلياز مي باشد كه با شكستن پيوند داخلي آلفا 1 و 4 آميلوز، آميلوپكتين و گليكوژن را هيدروليز مي نمايد. امروزه گونه هاي مختلف جنس باسيلوس منبع مهمي در توليد اين آنزيم به شمار مي روند. اين مطالعه با هدف همسانه سازي و بيان ژن كد كننده آلفا آميلاز (amyS) از باكتري باسيلوس ليكنيفورميس و تعيين خصوصيات بيوشيميايي آنزيم نوتركيب انجام شد. مواد و روش ها: توالي ژن مربوط به آنزيم آلفا آميلاز با استفاده از روش واكنش‌ زنجيره اي پلي مراز در باسيلوس رديابي و جداسازي گرديد. قطعات مورد نظر در ناقل بيانيpET-26b(+) وارد شدند. پس از توالي يابي قطعات، ناقلين نوتركيب به باكتري بياني اشرشيا كلي BL21(DE3) منتقل و بيان شدند. به منظور خالص سازي آنزيم نوتركيب از فيلتر آميكون و كيسه دياليز استفاده شد. براي اندازه گيري فعاليت آنزيم آلفا آميلاز از روش دي نيترو ساليسيليك اسيد استفاده گرديد. يافته ها: نتايج اين تحقيق نشان دهنده بيان فراوان آنزيم آلفا آميلاز در سيستم هاي بياني غير از خود باكتري باسيلوس بود. بر اساس الكتروفورز بر روي ژل SDS-PAGE، وزن مولكولي آنزيم نوتركيب معادل 54 كيلو دالتون گزارش گرديد. همچنين آنزيم داراي فعاليت نسبي 4/77 واحد در ميلي ليتر بود. نتيجه گيري: نتايج اين تحقيق بيانگر بيان فراوان اين آنزيم در سيستم هاي بياني ديگر مي باشد. اهميت اين سيستم به دليل وجود پروموتر قوي T7 است. به دليل بيان ترشحي آنزيم مورد نظر و در نتيجه تاخوردن صحيح و حفظ فعاليت آنزيم، استفاده از اين سيستم در مقياس صنعتي پيشنهاد مي گردد. Background & Objectives: ?-amylase, is an endoamylase to hydrolyses amylase, amylopectin and glycogen by randomly cleavage of internal alpha 1, 4 linkages. Genus Bacillus is one of the most common microbial sources of ?-amylase production. The aim of the present study is identification, overexpression and activity analysis of Bacillus licheniformis ?-amylase (amyS). Materials & Methods: A polymerase chain reaction was used to identify and isolate ?-amylase gene in Bacillus sp. The fragments were introduced into expression vector pET-26 (+). After sequencing, the recombinant vectors were introduced into E. coli BL21 (DE3) for expression. The recombinant enzyme were purified using amicon filter and dialysis bags. ?-amylase activity was measured using di-nitro salicylic acid technique. Results: Based on the results, the ?-amylase gene was over-expressed in an expression system beyond the native host (Bacillus sp.). Based on the SDS-PAGE electrophoresis, the molecular weight of this enzyme was predicted 54 KDa. The ?-amylase showed an enzyme activity about 4.77 U/ml. Conclusion: These results indicated a high expression of this enzyme in an expression system beyond the host, which was due to existence of a strong promoter used in this study, T7promoter. As a result, employment of this system in an industrial scale is recommended due to the secretion of the target enzyme, a proper folding of the enzyme and maintenance of its activity.