جداسازي اندام توليد سم و روش استخراج و شناسايي كونوتوكسين‌ها در حلزون‌ مخروطي Conus terebra thomasi

The Separation of Venom Apparatus, Purification and Identification Method of Conotoxins in Cone Snail Conus terebra thomasi

حلزون‌هاي مخروطي (Conus) گروهي از نرم‌تنان دريايي هستند كه به‌منظور اهداف متفاوت، تركيبات سمي (كونوتوكسين‌ها) را توليد مي‌كنند. در مطالعات متعددي خواص دارويي كونوتوكسين‌ها و وجود تركيبات سمي متفاوت در بخش‌هاي مختلف اندام مولد سم در گونه‌هاي مختلف بررسي شده است. شناخت ساده‌ترين و مناسب‌ترين روش براي جداسازي اندام توليد سم و استخراج كونوتوكسين‌ها ضروري به نظر مي‌رسد. بدين منظور تعدادي گونه‌ي Conus terebra thomasi از سواحل بخش‌هاي شمالي جزيره‌ي لارك (خليج فارس) جمع‌آوري و صدف نمونه‌ها بوسيله‌ي گيره ي آهني به آرامي شكسته شد. بعد از خارج سازي حيوان از صدف، خارج سازي دستگاه مولد سم با ايجاد يك برش كوچك در منطقه‌ي پشتي عضله‌ي پا انجام شد. دستگاه مولد سم با دقت به 3 بخش حباب سم، بخش ابتدايي مجرا و بخش انتهايي مجراي سم تقسيم و فريزدراي شدند. عصاره‌گيري با 3 حلال مختلف (استون خالص، مخلوط استون خالص- متانول20% و بافر فسفات نمكي) انجام و ميزان پروتيين كل با روش برادفورد اندازه‌گيري شد. نتايج نشان داد كه ميزان پروتيين كل در دو عصاره‌ي استوني و استوني متانولي بسيار كم و در حلال بافر فسفاتي قابل ملاحظه (حباب سم: 79/38، بخش ابتدايي مجرا: 4/52 و بخش انتهايي مجرا: 01/46 ميلي‌گرم/گرم بافت خشك) است. با استفاده از روش الكتروفورز عمودي كونوپپتيدهاي مختلفي در بخش‌هاي مختلف دستگاه مولد سم مشاهده شد. همچنين بين حلال‌هاي بررسي شده، بافر فسفات نمكي مناسب معرفي مي‌شود كه علاوه بر بالا بودن كونوپپتيدهاي استخراجي، احتمال آسيب ديدگي آنها از بين رفته و مناسب براي بررسي خواص زيست فعالي آنها خواهد بود.

Cone snails (genus: Conus) are groups of marine mollusks that make a group of toxin compounds (conotoxins) for different purposes. Several studies proved the medical properties of conotoxins and existence of different toxic compounds in different parts of venom apparatus. So, recognizing the simplest and the most suitable method for separating the venom apparatus and purification of conotoxins is necessary. For this purpose, several specimens of Conus terebra thomasi were collected from the Northern sandy coast of Larak Island and the shells of samples were cracked by vice. After pulling out the snail from its shell, drawing out of the venom apparatus was done by cutting the posterior section of foot muscle. Venom apparatus was divided into three parts, venom bulb, proximal and distal venom duct and each sample was freeze-dried. Extraction was done by three solvents (Acetone 100%, A mixture of Acetone100%-Methanol20% and Phosphate Buffered Saline) and the total protein of each extract was determined by Bradford protein assay. The results showed that the amount of total protein in two extracts (Acetone and Acetone-Methanol) were very low and cannot be measured by this method, but it is measurable in third extract (venom bulb: 38.79, proximal venom duct: 52.4 and distal venom duct: 46.01 mg/g dried tissue). By using electrophoresis method, different conopeptides were shown in different parts of venom apparatus. Also, the most suitable solvent between the checked solvents in this study is phosphate buffered saline because of high concentration of extracted conopeptides, and reducing the risk of tissue damage. Meanwhile, the extracted compounds are suitable for investigating their bioactivity.