همسانه سازي فرم اصلاح شده ژن tPAانساني در ناقل كلروپلاستي و باززايي گياهان ترانس پلاستوميك توتون

Cloning of the truncated Human tPA Gene in Chloroplast vector and regeneration of transplastomic tobacco plants

گياهان جايگزين مناسبي براي سيستم هاي معمول بيان پروتيين هاي نوتركيب و داروهاي زيستي، نظير حيوانات يا سيستم هاي ميكروبي تراريخته مي باشند. به دليل پلي پلوييدي بالاي ژنوم پلاستيد گياهي، در صورت تراريختي كلروپلاست، هزاران نسخه از ژن خارجي در هر سلول وارد و حجم بسيار بالايي از پروتيين نوتركيب توليد مي شود. پس از سرطان ها، بيماريهاي قلبي- عروقي دومين عامل مرگ و مير انساني هستند. فعال كننده پلاسمينوژن بافتي انساني (tPA) يكي از مهمترين پروتيين هاي نوتركيب دارويي است كه جهت از بين بردن لخته خون در قسمت هاي مختلف بدن از جمله رگ هاي خوني قلب و مغز استفاده مي شود. فرم اصلاح شده پلاسمينوژن بافتي (K2S) داراي نيمه عمر پلاسمايي طولاني تر، قدرت نفوذ در لخته و فعاليت فيبرينوليتيك بالاتر مي باشد. در اين مطالعه، به منظور انتقال ژن K2S به كلروپلاست گياه توتون، پس از طراحي سازه، ژن هدف در ناقل كلروپلاستي pKCZ درج و سپس در باكتريcoli .E همسانه سازي گرديد. پس از شليك موفق ناقل حاوي ژن K2S (pKCZK2S) به ريزنمونه هاي برگي با استفاده از تكنيك بيولستيك، ريزنمونه ها بر روي محيط انتخابي حاوي 500 ميلي گرم در ليتر آنتي بيوتيك اسپكتينومايسين قرار گرفتند. پس از باززايي نوساقه هاي رشد يافته بر روي محيط انتخابي، به منظور رسيدن به هموپلاسمي چهار دوره انتخاب و باززايي در حضور آنتي بيوتيك اسپكتينومايسين انجام شد. حضور، درج در جايگاه مشخص، بيان ژن K2S و هموپلاستي در گياهان ترانس پلاستوميك با روش هاي PCR، RT-PCR و سادرن بلات به تاييد رسيد.

Plants are suitable replacements for current biodrugs and recombinant protein expression systems such as transgenic animals or microbial systems. As the plant plastid genome is highly polyploid, the transformation of chloroplast permits the introduction of thousands of copies of foreign gene per plant cell and generates extraordinarily high levels of recombinant protein. Cardiovascular diseases are the second one leading cause of human mortality after cancer. Human tissue-type plasminogen activator (tPA) is one of the most important pharmaceutical recombinant proteins involved in the breakdown of blood clots in different parts of body such as brain and heart blood vessels. The truncated form of tissue plasminogen activator (K2S) has longer plasma half life, better diffusion into the clot and higher fibrinolytic activity. In this study, in order to introduction of K2S gene in tobacco chloroplast, after construct design, the interest gene was ligated to pKCZ vector and cloned in E. coli. Following the successfully shooting of the K2S-containing vector (pKCZK2S) to leaf explants using the biolistic delivery procedure, the explants were selected on selection medium containing 500 mgL-1 spectinomycine antibiotic. After regeneration of grown shoots on selective medium, in order to achieve homoplasmy, fourth rounds of selection and regeneration in presence of spectinomycine antibiotic were performed. The presence, site-specific integration, expression of the K2S gene and homoplasmy in transplastomic plants were confirmed by PCR, RT-PCR and Southern blotting methods.