شناسايي همزمان و مقايسه بروسلاهاي بيماري زا در بين نمونه‌هاي سرمي و خون انسان به روش Multiplex PCR وتاييد نتايج آن با روش PCR-RFLP

Simultaneous identification and comparison of pathogenic Brucella species in human serum and blood samples by means ofmultiplex PCR and confirmation of the results by PCR-RFLP

چكيده مقدمه: مطالعات كمي در خصوص جداسازي بروسلا آبورتوس و بروسلا ملي تنسيس عامل بروسلوزيس از سرم بيماران انجام است، اين مطالعه با هدف جداسازي همزمان بروسلاهاي بيماري زا از نمونه‌هاي سرمي انسان به روش Multiplex PCR طراحي گرديد. روش ها: در اين مطالعه آزمايشگاهي، 50 نمونه خون و سرم بيمار مشكوك با علايم باليني بروسلوزيس، پس از تيترسنجي به محيط كشت بروسلا اگار تلقيح شده و براي تشخيص، از تكنيك مولكولي Multiplex-PCR با سه پرايمر استفاده شد. به منظور كشت نمونه‌هاي سرم، ml 5/0 از سرم در بروسلا براث تلقيح شده و به مدت 72 ساعت در انكوباتور 37 درجه سلسيوس و 5% گاز دي اكسيد كربن، گرمخانه گذاري شد. براي تاييد نتايج PCR، محصولات PCR با استفاده از آنزيم هاي برش دهنده TaqI و RsaI مطابق مطالعات قبلي تحت برش آنزيمي قرار گرفتند. يافته ها: از ميان 50 نمونه خون 4 مورد (8%) كشت مثبت بودند كه هر 4 مورد (100%) پس از بررسي خصوصيات و انجام تست هاي بيوشيميايي و افتراقي به عنوان بروسلا ملي تنسيس شناسايي شدند. پس از انجام Multiplex PCR، 9 مورد (18%) مثبت و 41 مورد (82%) منفي بودند. در ميان موارد مثبت سرم، باند مربوط به بروسلا ملي تنسيس در 7 مورد (78%) و باند مربوط به بروسلا ابورتوس در 2 مورد (22%) مشاهده گرديد. از مجموع 50 نمونه خون 5 مورد (10%) مثبت و 45 مورد (90%) منفي بودند كه در تمامي آن‌ها (100%) باند مربوط به بروسلا ملي تنسيس مشاهده گرديد. تمام نتايج با روش PCR_RFLP تاييد شد. نتيجه گيري: مطالعه ما نشان داد كه اين روش ساده و سريع بوده و حساسيت آن براي جداسازي بروسلاها (به خصوص بروسلا ابورتوس و ملي تنسيس) از سرم در مقايسه با خون كامل، بيشتر است. كلمات كليدي: بروسلا، Multiplex-PCR، سرم خون، PCR-RFLP

ABSTRACT Background and Aim:There are few studies on the isolation of Brucellaabortus and Brucellamelitensisfrom patients´ sera.The aim of this study wassimultaneous isolation of pathogenic brucella species from human serum samples by multiplex PCR method. Material andMethods:50 blood and serum samples isolated from patients with clinically suspected brucellosis were inoculated into brucella agar medium and we used multiplex-PCR, with three primers to detect brucella species. We incubated 0.5 ml of serumin Brucella broth for 72 hours at 37 °C in 5% carbon dioxide. To confirm the results of PCR, the PCR products were restricted by restriction enzymes,TaqI and RsaI. Result: From 50 blood samples 4 (8%) cultures were positive. Using biochemical tests and after determination of the characteristics of the positive cases, they were identified as B.melitensis. After multiplex PCR, 9 cases (18%) were positive and 41 cases (82%) were negative. Among the positive sera, B.melitensiswas identified in 7 cases (78%) and B. abortus in 2 cases (22%). Of 50 blood samples, 5 (10%) were positive and 45 (90%) were negative for B.melitensis. All the results were confirmed by PCR-RFLP. Conclusion:Our study showed that multiplex PCR method was simple, rapid and is more sensitive for isolation of brucellafrom serum (especially B. abortus and B.melitensis)in comparison to complete blood. Keywords: Brucellaspp., Multiplex-PCR, Serum blood, PCR-RFLP