بررسي و مقايسه فاكتور هاي استرس ORS و pH بر تشكيل بيوفيلم و فرم پلانكتوني E.coli O157:H7

Cloning and expression of Deinococcus radiodurans drRRA gene in E. coli Origami strain

سابقه و هدف: باكتري E.coli O157:H7 از خانواده انتروباكترياسه باسيل گرم منفي مي باشد كه منجر به بيماري هاي گوارشي شديد اسهال، كوليت هموراژيك، سندرم اورمي هموليتيك مي شود. هدف از اين مطالعه بررسي و مقايسه فاكتور هاي استرس ORS و pH بر تشكيل بيوفيلم و فرم پلانكتوني E.coli O157:H7 در هر دو حالت در دماي 37 درجه سانتي گراد مي باشد و بررسي شكل باكتري مذكور در شرايط استرس هاي، pH و پودر ORS در حالت ميكروسكوپي(شكل باكتري) و ماكروسكوپي (شكل كلني باكتري در محيط كشت نوترينت آگار) مي باشد. مواد و روش ها: سويه باكتري E.coli O157:H7 از موسسه واكسن و سرم سازي رازي به شماره 2323 (RITCC) خريداري شد. باكتري در شرايط استرس در محيط نوترينت براث مايع قرار داده شد و بعد از آن براي ديدن شكل كلني به محيط نوترينت آگار در پليت برده شد و شكل كلني و همچنين شكل باكتري با رنگ آميزي گرم مورد بررسي قرار گرفت. تعداد باكتري هاي زنده در استرس با روش پور پليت با تهيه رقت انجام شد. براي تعيين قدرت تشكيل بيوفيلم در استرس ها از روش مورد تاييد ميكروتيتر پليت استفاده گرديد و با دستگاه الايزا ريدر خوانده شد. يافته ها: شكل باكتري در حالت استرس تحت تاثير قرار گرفت. در شرايط استرس مورفولوژي كلني و شكل باكتري تغيير محسوسي پيدا مي كند و شكل باكتري در استرس تمايل به سمت كوكسي شدن و باسيل دارد تا بتواند بقا بيشتري داشته باشد. بقاي باكتري در شرايط استرس در حالت بيوفيلم خيلي بيشتر از حالت پلانكتوني مي باشد. نتيجه گيري: اين تغييرات ارتباط مستقيمي با بقا بيشتر باكتري در دستگاه گوارش داشته و مانع اثر تركيبات آنتي باكتريال مختلف طبيعي دستگاه گوارش به باكتري شده و مقاوت باكتري در شرايط بيوفيلم بيشتر از حالت پلانكتوني است

Aim and Background: Deinococcus radiodurans is one of the most radio resistant microorganisms able to survive in an extreme environment. Available data show that multiple DNA repair and antioxidant proteins are involved in radio resistance. DrRRA is a novel response regulator essential for the radio resistant of Deinococcus radiodurans. The aim of this study was cloning and expression of drRRA gene in E. coli system. Material and methods: The drRRA gene of Deinococcus radiodurans was synthesized in pGEM-B1 vector and the synthetic gene was subcloned to pET21a expression vector. Subcloning of the gene was verified by double digestion and sequencing. The cloned gene was expressed in E. coli (Origami strain). Expression of recombinant DrRRA (rDrRRA) was confirmed by polyacrylamide gel electrophoresis and Western blotting. Results: The chimeric pET21a plasmid containing the C-terminal fusion of His-tag with DrRRA was successfully constructed. Recombinant DrRRA was intracellularly produced by transformed E. coli. Conclusion: The results of this study indicated that subcloning and expression of drRRA gene in E. coli is feasible. In addition, the expression level of protein was suitable and it should be analyzed in prokaryotic and eukaryotic systems.