جداسازي، همسانه‌سازي و توصيف ملكولي ژن‌هاي رمزكننده آنزيم‌هاي اندونوكلياز اختصاصي تك‌رشته از گياه جعفري (Petroselinum crispum L.)

Isolation, cloning and molecular characterization of genes encoding single-strand specific endonucleases from Parsley (Petroselinum crispum L.)

نوكليازهاي اختصاصي تك‌رشته (خانواده S1/P1)، بطور گسترده در تحقيقات ژنتيك مولكولي مورد استفاده قرار مي گيرند. پركاربردترين آنزيم هاي اين خانواده، اندونوكليازهاي گياهي هستند كه از قابليت برش اختصاصي نواحي جفت شدگي ناجور در مولكول هاي DNA هترودوپلكس برخوردارند. تكنيك هضم آنزيمي DNA هترودوپلكس مبتني بر فعاليت اين اندونوكليازها، يكي از متداول‌ترين تكنيك‌هاي مورد استفاده براي شناسايي جهش‌هاي نقطه‌اي در ژنوم است. در اين تحقيق، توالي‌هاي ژني رمزكننده آنزيم‌هاي اندونوكلياز اختصاصي تك‌رشته از گياه جعفري (Petroselinum crispum) با استفاده از آغازگرهاي هترولوگ در واكنش PCR جداسازي گرديدند. توالي هاي ژني جداسازي شده، پس از همسانه سازي و تعيين ماهيت، به نام‌هاي PARS I و PARS II نامگذاري شدند. مطالعه نرم‌افزاري خصوصيات فيزيكوشيميايي، ساختار مولكولي و قرابت ژنتيكي نشان داد كه دو آنزيم PARS I و PARS II به خانواده نوكليازهاي S1/P1 تعلق داشته و شباهت زيادي به نوكليازهاي اختصاصي DNA هترودوپلكس نشان مي‌دهند. با اين حال، تعيين مكانيزم فعاليت و ترجيح سوبسترايي اين نوكليازها، مستلزم بررسي فعاليت نمونه خالص طبيعي يا نوتركيب آنها بر روي سوبستراي DNA هترودوپلكس مي باشد.

Single-strand specific (sss) nucleases (S1/P1 family) are widely used in molecular genetics studies. The most widely used sss-nucleases are those plant endonucleases with the ability of specific cleavage of mismatch loops in heteroduplex DNA molecules. Because of the valuable activity of these endonucleases, enzymatic cleavage of heteroduplex DNA molecules is one of the most common techniques of point mutation detection in genomes. In this study, gene sequences encoding single-strand specific endonucleases were isolated from parsley (Petroselinum crispum L.) using heterologous primers in PCR reactions. The isolated gene sequences, after cloning and molecular identification, were designated as pars I and pars II. Physicochemical, structural and phylogenetic analysis using software tools, verified PARS I and PARS II as two members of S1/P1 family with a substantial homology to heteroduplex DNA specific endonucleases. However, it is essential to produce pure enzyme preparations as native or recombinant forms to determine mechanisms of activity and substrate preferences of these nucleases on heteroduplex DNA substrates.