ايجاد وكتورهاي تداخلي يوكاريوتي از pSVM با انتقال ناحيه‌ي توالي اتصال در ژنوم (attB) به آن

Construction of eukaryotic integrative vectors by insertion of the integration region attB in pSVM

زمينه و هدف: ساليان زيادی است كه انواع مختلفی از سلول‌های تخمدان هامستر چينی (CHO) غالباً برای توليد اكثر محصولات دارويی استفاده می‌شود. توليد دائمی در اين سلول‌های ميزبان، يك چالش بزرگ است. هدف از اين مطالعه، همسانه سازی ناحيه ی توالی اتصال در ژنوم باكتری (attB) در وكتور pSVM با استفاده از سيستم نوتركيبی phiC31 برای بقای طولانی وكتور در سلول‌های C‏HO بوده است. روش بررسی: در اين مطالعه تجربی آزمايشگاهی، يك جايگاه برش آنزيم محدود كننده‌ی PvuII به عنوان جايگاه كلونينگ توسط نرم افزار CLC در وكتور pSVM انتخاب كه برش با اين آنزيم منجر به ايجاد دو انتهای صاف در وكتور شد. دو پرايمر اختصاصی برای جداسازی و تكثير ناحيه‌ی attB از وكتور pDrBB2 توسط نرم افزار 5 Oligo®طراحی شد. ژل الكتروفورز و آناليز PCR بر روی قطعه تكثيرشده در جهت تاييد ساختار آن انجام شد. يافته ها: ناحيه‌ی attB به طور موفق در داخل وكتور pSVM الحاق شد و توسط ژل الكتروفورز نشان داده شد. در جهت تاييد ورود ژن attB در وكتور pSVMواكنش colony PCR از كلنی‌های نوتركيب انجام شد و صحت كلونينگ با مشاهده‌ی باند مربوط به ترادف attB انجام گرفت. نتيجه گيری: در اين تحقيق، جايگاه attB در پلاسميدpSVM همسانه سازی گرديد. با بهره گيری از اين اطلاعات و وجود جايگاه psedo-attP در كروموزوم سلول‌های CHO، می توان بعد از الحاق ژن اينترفرون انسانی در اين پلاسميد، و ورود اين پلاسميد و پلاسميد حاوی آنزيم اينتگراز به سلول‌های CHO برای اولين بار زمينه‌ی پايداری بيان اين پروتئين را در سلول‌های CHO فراهم كرد.

Background and aims: Different varieties of Chinese Hamster Ovary (CHO) cells are being used frequently for producing most pharmaceutical products for many years. Permanent production in these host cells is a major challenge. The aim of this study was to integrate the vector permanently in the genome. In this study, the phiC31 site-specific recombination system was used for prolonged maintenance of the vector in the CHO cells. Methods: In this laboratory experimental study, a restriction enzyme cut site (PvuII) was selected as a cloning site in the pSVM vector using CLC software. Cutting with this enzyme led to create two blunt ends into the vector. Two specific primers were designed for isolation and amplification of attB region from pDrBB2 vector, using Oligo®5 software. Gel electrophoresis and PCR analysis were performed on the amplified fragment in order to confirmation of its structure. Results: The attB region was successfully integrated in to pSVM vector and was shown by gel electrophoresis. Colony PCR technique has revealed the correct structure of the reconstructed vectors. Conclusion: In this study, the phiC31 integrate catalyzes recombination between pseudo-attP sites (in CHO chromosomes) and attB site. A new construct has been made in this project containing attB site. This construct has to be introduced into CHO cells accompanied with pCMV-int vector (co-transfection) containing integrase. This integrase facilitates the incorporation of the pSVM vector into the chromosome, in order to get a permanent existence of the new construct into the CHO cells.