بررسي مقايسه‌اي روش‌هاي مولكولي PCR-RFLP، آلل اسپسيفيك PCR و سكوينس جهت تشخيص سريع مقاومت به ايزونيازيد در سويه‌هاي كلينيكي مايكوباكتريوم توبركلوزيس

Comparison of PCR-RFLP and Allele Specific-PCR and sequencing in rapid diagnosis of isoniazid resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis

زمينه: ايزونيازيد يكي از داروهاي خط اول درمان سل مي‌باشد كه مقاومت به آن به‌صورت فزاينده‌اي گزارش مي‌شود. در مطالعه حاضر دو روش مولكولي جهت تشخيص سريع مقاومت سويه‌هاي كلينيكي مايكوباكتريوم توبركلوزيس به ايزونيازيد طراحي و با نتايج سكوينس مورد مقايسه قرار گرفتند. مواد و روش‌ها: در اين مطالعه 60 سويه كلينيكي مايكوباكتريوم توبركلوزيس، كه با روش تعيين حساسيت دارويي (DST) مقاومت به ايزونيازيد در آن‌ها اثبات شده، استفاده گرديد. سه روش مولكوليSequencing ،PCR-RFLP و Allele Specific-PCR جهت تعيين موتاسيون در كدون 315 مرتبط با مقاومت به ژن katG مقايسه شدند. بدين منظور با كمك پرايمرهاي اختصاصي كه قادر به تشخيص موتاسيون در اين كدون بودند، روش آلل اسپسفيك اجرا گرديد. علاوه بر اين، در روش PCR-RFLP از آنزيم HpaII جهت برش آنزيمي محصولPCR استفاده شد، عدم برش توسط آنزيم به‌عنوان رخداد موتاسيون در نظر گرفته شد. يافته‌ها: بدين‌منظور سويه‌هاي حساس، مقاوم به دارو و سويه استاندارد H37Rv مورد استفاده قرار گرفتند. از سويه‌هاي مورد مطالعه، تعداد 27 سويه مقاوم و 33 سويه حساس به ايزونيازيد بودند. نتايج سكوينس به‌عنوان استاندارد طلايي مشخص نمود كه AS-PCR و PCR-RFLP به‌خوبي قادر به تشخيص موتاسيون در كدون 315 در سويه‌هاي مقاوم فنوتيپي با حساسيت و ويژگي به‌ترتيب 48/81 درصد و 100 درصد بودند. نتيجه‌گيري: نتايج مطالعه حاضر نشان مي‌دهد كه روش‌هاي PCR-RFLP و AS-PCR طراحي شده مي‌توانند به‌عنوان روش‌هاي ساده و سريع براي تعيين حساسيت و مقاومت به ايزونيازيد در سويه‌هاي مايكوباكتريوم توبركلوزيس مورد استفاده قرارگيرند. پيشنهاد مي‌شود جهت كاهش ريسك خطا، با توجه به ساده و كم هزينه بودن به‌صورت همزمان از هر دو تست براي تشخيص مقاومت به ايزونيازيد استفاده شود.

Background: Isoniazid is from the first-line drugs for treatment of tuberculosis. Resistance to Isoniazid is increasingly reported. In the study, molecular methods for rapid detection of isoniazid resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis were compared. Materials and Methods : Sixty clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis were selected and their resistance and susceptibility were determined by proportional method. Molecular methods of PCR-RFLP and Allele Specific-PCR (AS-PCR) for determination of probably mutation in codon 315 of katG gene that related to Isoniazid resistance were used and compared by sequencing results as gold standard. In AS-PCR specific primers by proper PCR conditions were used. RFLP analysis of the PCR products was performed using the enzyme HpaII. Results: From 60 studied strains, 27 isolates were resistant and 33 strains were susceptible to isoniazid. Sequencing results showed that AS-PCR and PCR-RFLP well able to detect mutations in codon 315 of the strains by 81.48% sensitivity and 100% specificity respectively. None of the susceptible strains harbored mutation in katG315. Conclusion: Our results indicated that PCR-RFLP and AS - PCR methods were simple and fast methods for determination of isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis. These rapid and low cost methods is recommended simultaneously to reduce the risk of error in routine work.