بيان و تعيين خصوصيات فتوپروتيين i-Photina به‌عنوان يك پروتيين كارآمد

Expression and Characterization of i-Photina as an Efficient Photoprotein

زمينه: امروزه استفاده از فتوپروتيين‌ها به واسطه سيگنال كم پس زمينه‌اي جايگاهي ويژه يافته است. از بين فتوپروتيين‌هاي رايج اكثر مطالعات روي فتوپروتيين اكورين متمركز شده است. اما به دليل پايين بودن شدت سيگنال و نيز بالا بودن سرعت خاموشي آن در سنجش‌هاي HTS (High-Throughput Screening) چندان كارآمد نمي‌باشد. در اين راستا محققين در سال 2004 سه فتوپروتيين ارتقا يافته به منظور تشخيص مقادير ناچيز كلسيم به نام‌هاي Photina، i-Photina و c-Photina توليد كردند. اين فتوپروتيين‌ها به واسطه سيگنال‌دهي قوي و نيز بادوام‌تر خود نسبت به موارد مشابه، دريچه‌ي نويني را به روي كاربرد بيولومينسانس در سنجش‌هاي HTS گشوده‌اند و در حال حاضر فرم تجاري اين سه فتوپروتيين توسط شركت‌هايي از جمله Axxam و PerkinElmer عرضه مي‌گردد. در اين تحقيق فتوپروتيين i-Photina به‌دليل شدت سيگنال بالاتر و همچنين پايداري نسبتاً مناسب آن نسبت به دو فتوپروتيين ديگر جهت مطالعه انتخاب شد. مواد و روش‌ها: ابتدا ترجيح كدوني ژن i-Photina بر اساس سلول‌هاي پستانداران و E. coli تنظيم گرديد. سپس توالي مربوطه سنتز و در باكتري E. coli بيان شد. در مرحله بعد مقايسه‌اي بين خصوصيات بيولومينسانسي i-Photina و اكورين صورت گرفت. يافته‌ها: نتايج به‎دست آمده نشانگر حدود 14 برابري شدت سيگنال i-Photina نسب به اكورين مي‌باشد. همچنين حساسيت به Ca2+ در i-Photina كمي كم‌تر از اكورين به‌دست آمد. ساير خصوصيات همچون پايداري پروتيين، طيف نشري و سرعت خاموشي در دو فتوپروتيين تفاوت قابل توجهي نشان ندادند. نتيجه‌گيري: فتوپروتيين i-Photina علاوه‌بر اينكه جايگزيني مناسب براي اكورين در سنجش‌هاي HTS مي‌باشد، مي‌تواند به‌عنوان كانديدي بالقوه براي ايجاد جهش‌هاي ژنتيكي به منظور بهبود خصوصيات بيولومينسانسي نيز مطرح گردد.

Background: Nowadays photoproteins are excellent reporter systems as they have virtually no background. The most commonly studied photoprotein is aequorin. But because of it’s low quantum yield and very fast reaction kinetic; this photoprotein assay don’t adapt for High-Throughput Screening (HTS). Consequently, some researchers developed three improved photoproteins optimized for the generation of precise Ca2+ mobilization assays; photina, i-photina and c-photina. Although the total light release of these photoproteins is greater and their reaction kinetic is slower compared to other existing photoproteins, opening new opportunities for the application of flash luminescence assays in HTS. Recently, the three photoproteins by several companies such as PerkinElmer and Axxam have been commercialized. So, we selected i-photina which has the highest luminescence signal and good stability compared with two other photoproteins. Materials and Methods : Codon usage of i-Photina was optimized for both E. coli and mammalian cells. The encoding gene of i-photina was synthesized and overexpressed in E. coli. Then i-Photina was characterized and compared with aequorin. Results: i-Photina showed about a 14-fold higher bioluminescence signal than aequorin. Ca2+ sensivity of i-Photina was found to be slightly less than aequorin. In respect to other measured properties such as degree of stability, bioluminescence spectrum and decay half-life time, these two photoproteins were almost the same. Conclusion: i-Photina is an improved version of photoprotein that in many ways is superior to use of other Ca2+ indicators for HTS assays and can also be considered as a potential candidate for creating genetic mutations improved the bioluminescence propertises.