توليد و تخليص آنتي بادي پلي كلونال عليه كلرا توكسين

Production and Purification of Polyclonal Antibody against Cholera Toxin

سابقه و هدف: وبا بيماري خطرناكي است كه توسط باكتري ويبريو كلرا ايجاد مي‌ شود. توكسين كلرا مهم‌ترين عامل ويرولانس در بيماريزايي ويبريوكلرا مي باشد. زير واحد B انتروتوكسين (CTxB) كه مسيول اتصال سم به سلول يوكاريوتي است، ويژگيهاي ايمونوژنيك دارد. هدف از اين تحقيق توليد و تخليص آنتي بادي عليه پروتيين نوتركيبCTxB مي‌باشد. مواد و روشها: پروتيين نوتركيب CTxB بيان و با كروماتوگرافي ميل تركيبيNi-NTA تخليص گرديد. تعداد 10 موش BALB/C با سن پنج هفته به دو گروه كنترل و تست تقسيم شدند. هر موش از گروه تست، 10 ميكروگرم از پروتيين نوتركيب را به همراه ادجوان فروند به صورت زير جلدي دريافت كرد. تيترآنتي بادي در موشهاي ايمن شده به روش الايزا بررسي شد. سرم موشهاي دريافت كننده PBS به عنوان كنترل در روش الايزا استفاده شد. IgG به وسيله ستون تمايلي پروتيين G خالص گرديد. اثر مهاري آنتي بادي ضد CTxB بر روي توكسين با استفاده از روش GM1-ELISA ارزيابي شد. يافته‌ها: نتايج الايزا واكنش اختصاصي پروتيين نوتركيب با آنتي بادي ضد توكسين كلرا را نشان داد. ميزان پروتيين خالص شده براي هر ليتر از محيط 9 ميلي گرم بود. نتايج الايزا نشان داد پس از هر بار تزريق ميزان توليد آنتي‌بادي در بدن موش‌ها افزايش يافته است. ميزان جذب مربوط به سرم با رقت 1/500 بالاتر از 3 بود. غلظت آنتي بادي تخليص شده بر طبق روش برادفورد،mg/ml 1 بود. در واكنش الايزا، 156 نانوگرم از زير واحد اتصالي سم توسط آنتي بادي شناسايي شد. اتصال توكسين به GM1 كوت شده با استفاده از سرم حيوان ايمن شده تا 70 درصد كاهش يافت. نتيجه گيري: نتايج اين تحقيق كارايي پروتيين CTxB نوتركيب به عنوان ايمونوژن موثر تحريك كننده پاسخ هومورال عليه توكسين كلرا را نشان داد. آنتي بادي ضد زير واحد B نوتركيب، توانايي شناسايي توكسين و مهار اتصال آن به گيرنده GM1 را دارا است.

BACKGROUND AND OBJECTIVE: Cholera is a debilitating enteric disease, caused by Vibrio cholerae. Cholera toxin is the most important virulence factor in the pathogenesis of Vibrio cholera. Cholera toxin B subunit (CTxB), which forms a bond between the toxin and eukaryotic cells, has immunogenic features. The purpose of this study was to produce and purify antibodies against CTxB recombinant protein. METHODS: The CTxB recombinant protein was expressed and purified by Ni-NTA affinity chromatography. In total, ten 5-week-old BALB/C mice were divided into control and test groups. The test group subcutaneously received 10 micrograms of the recombinant protein along with Freundʹs adjuvant. Antibody titers were measured by ELISA method. The serum of immunized mice, receiving phosphate-buffered saline, was used in ELISA as the control. Immunoglobulin G was purified by the use of affinity column of G protein. The inhibiting effect of antibody against CTxB on toxin was examined using GM1-ELISA method. FINDINGS: The results of ELISA method showed the binding of recombinant protein to cholera toxin antibody. The amount of purified protein for each liter of the medium was 9 milligrams. ELISA findings showed that after each injection, the amount of antibody in mice was increased. The absorption rate of serum with the dilution of 1:500 was higher than three. According to Bradford assay, the density of purified antibody was 1 mg/ml. In ELISA’S reaction, 156 ng of toxin-binding subunit was identified by the antibody. The binding of toxin to GM1 increased by 70%, using immunized animal serum. CONCLUSION: The results of this study showed the efficiency of CTxB recombinant protein as an effective immunogen for provoking humoral response against cholera toxin. The antibody against the recombinant B subunit was able to identify toxins and inhibit its binding to GM1 receiver. KEY WORDS: Vibrio Cholera, B Subunit of Cholera, Recombinant Protein, Polyclonal Antibody, GM1-ELISA.