توليد هورمون رشد انساني نوتركيب در سويه اوريگامي اشريشياكلي و مقايسه ميزان استخراج آن با دو روش اولتراسونيك و انجماد و ذوب

Production of recombinant human growth hormone in Eschericia coli strain Origami and comparing freeze/ thaw and sonication methods for proteins extraction

 مقدمه: هورمون رشد انسانی يك پروتئين تك‏رشته است كه دارای 191 اسيد‏آمينه و وزن مولكولی حدود 22 كيلودالتون است. به علت فعاليت‏های زيستی مهم و متنوع هورمون رشد، اين هورمون دارای كاربردهای گسترده‏ايی در پزشكی و بيوتكنولوژيست. از اواخر سال 1970 استفاده از بيان ژن برای توليد پروتئين‏های نوتركيب صنعتی تبديل به يك صنعت چند ميليارد دلاری شده است. از طرفی مشكلاتی كه در استخراج پروتئين درون‏سلولی وجود دارد باعث شده است كه چندين روش برای اين كار ارايه شود كه در بسياری از اين روش‏ها نياز به تجهيزات خاص است. اما در بيشتر مطالعات، پژوهشگران نياز به يك روش سريع و ارزان قيمت برای تخريب سلول دارند. هدف اين پژوهش، توليد هورمون رشد انسانی توتركيب و مقايسه ميزان استخراج آن با روش انجماد و ذوب و روش اولتراسونيك در سويه اوريگامی ‏اشريشياكلی است‏‏. ‏‏‏ مواد و روش‏‏ها: سلول‏ها‏ي مستعد سويه اوريگامی ‏اشريشياكلی با وكتور حاوی ژن هورمون رشد انساني ترانسفورم شده و با كشت در محيط LB و القا با IPTG هورمون رشد انسانی نوتركيب توليد و با دو روش انجماد و ذوب و اولتراسونيك، استخراج و سپس اين پروتئين با استفاده از روش‏ها‏ي الايزا، برادفورد، دات‏بلات و وسترن‏بلات بررسی شد. ‏‏‏ نتايج: عمل ترانسفورم كردن باكتری با كارايی بالايی انجام گرفت و نتايج حاصل از دات‏بلات و وسترن‏بلات نشان داد كه پروتئين هورمون رشد انسانی نوتركيب به خوبی توليد شد. با استخراج پروتئين با روش‏ها‏ی انجماد و ذوب و اولتراسونيك و بررسی نتايج حاصل از روش‏های الايزا و برادفورد مشخص شد كه ميزان پروتئين استخراج شده در روش انجماد و ذوب آهسته بيشتر از انجماد و ذوب سريع و كمابيش هم اندازه پروتئين استخراج شده در روش اولتراسونيك است. ‏‏‏ بحث و نتيجه‏گيری: برابر بودن ميزان پروتئين استخراج شده در روش انجماد و ذوب آهسته و روش اولتراسونيك نشان دهنده اين است كه روش انجماد و ذوب آهسته، در مواردی كه امكان استفاده از تجهيزات خاص و گران‏قيمت مثل اولتراسونيك وجود ندارد، جايگزين مناسبی برای اين روش است. ‏‏‏ 

 Introduction: Human growth hormone (hGH) is a single-chain polypeptide derived from pituitary gland that participates in a wide range of biological functions and has therapeutic applications. The hormone consists of 191 amino acid residues (22kD) which folds into a four-helix bundle structure with two disulfide bridges. Due to the complication of internal cell protein extraction, several methods have been established for this purpose that most of them need special instruments. Thus, in the preliminary studies, scientists need a quick and simple method for cell disruption and protein extraction. The aim of the present study was production of hGH in E.coli and comparison between the freeze/thaw and Sonication method for protein extraction from cells. Materials and methods: The competent cells of E. coli Origami (DE3) were transformed using plasmid containing human growth hormone gene and then cultured in LB medium. After IPTG induction, the hGH was extracted using various methods including bacterial lysing, freeze/thaw and sonication methods and then extracted protein was assessed using ELISA, Bradford, dot blot and Western blotting. Results: According to our findings, bacterial transformation showed high efficiency of transformation. Furthermore, the results of dot blot and Western blot showed production of recombinant hGH at high levels. Protein extraction measurement using ELISA and Bradford methods indicated that the proportion of the extracted protein in the slow freeze/thaw method was higher than the fast freeze/thaw method and was almost equal to sonication method. Discussion and conclusion: The extracted protein levels in both of the slow freeze/ thaw and ultrasonic methods was equal, which introduces the slow freeze/thaw method as an excellent substitution for ultrasonic method when special instruments are not available.