جداسازي و شناسايي باكتري‏هاي مولد بيوپليمر پلي‏هيدروكسي‏آلكانوآت از خاك‏هاي آلوده به نفت منطقه مسجد سليمان و بهينه‏سازي شرايط توليد

Isolation and identification of PHA producing bacteria from oil contaminanted soils in Masjed Soleiman and optimization of producing conditions

مقدمه: پلي هيدروكسي‏آلكانوآت (PHA) از جمله پليمرهای زيست تخريب پذير است كه توسط باكتري‏ها توليد مي‏شود و كاربرد آن به‏جای پلاستيك‏هاي پتروشيميايی مي‏تواند موجب كاهش آلودگی محيط زيست شود. هدف از پژوهش حاضر، جداسازي و شناسايی باكتري‏های مولد PHA از ناحيه نفتی مسجدسليمان، تعيين درصد PHA توليدی توسط اين باكتري‏ها، تعيين شرايط بهينه دما، اسيديته، غلظت و نوع منابع كربن و نيتروژن بر ميزان سنتز PHA و امكان استفاده از پسماندهای نفتی به عنوان بستر ارزان قيمت كربن برای سنتز PHA توسط باكتري‏های جداشده است‏‏. مواد و روش‏‏ها: در ابتدا 9 نمونه خاك از چهار ناحيه آلوده به نفت مسجدسليمان برداشت شد و غربال‏گری اوليه با استفاده از محيط MSM در دمای 28 درجه سانتي‏گراد انجام گرفت. جدايه‏ها از نظر توليد PHA با استفاده از رنگ آميزی سودان سياه تاييد و با استفاده از آزمون‏‏های فنوتيپی و تعيين توالی 16S rRNA تعيين هويت شدند. بهينه‏سازی ‏دما، اسيديته، منابع كربن و نيتروژن برای رشد باكتري‏ها نيز انجام شد. نتايج: در اين پژوهش، 11 جدايه مولد PHA شناسايی شد كه از بين آن‏ها جدايه MIS-1 با 522/58 درصد وزن خشك سلولی بيش‏ترين ميزان PHA را توليد مي‏كرد. اين جدايه بر اساس ويژگي‏هاي فنوتيپی و بررسی توالی 16S rRNA با 95 درصد شباهت متعلق به گونه Pseudomonas aeruginosa تشخيص داده شد. به‏علاوه نتايج آزمون‏‏های بهينه‏سازی نشان داد كه اين جدايه در دمای 37 درجه سانتي‏گراد، اسيديته 7، گلوكز به عنوان منبع كربن، سولفات آمونيوم به عنوان منبع نيتروژن و در نهايت، غلظت 10 گرم بر ليتر منبع كربن و غلظت 5/0 گرم بر ليتر منبع نيتروژن بالاترين ميزان PHA را سنتز مي‏كند. بحث و نتيجه‏گيری: نتايج اين پژوهش نشان مي‏دهد كه خاك های آلوده به نفت منطقه مسجدسليمان به علت آلودگی طولانی مدت و ميزان كربن بالا، زيستگاه مناسبي برای غربال‏گری باكتري‏های مفيد از جمله مولد PHA هستند.

Introduction: Polyhydroxyalkanoate (PHA) is counted biodegradable polymer, produced by bacteria, which is employed instead of petrochemical plastics, to reduce environment pollution. The purpose of this study is the isolation and identification of the PHA producing bacteria in Masjed-Soleiman oil fields, determination of PHA produced by the bacteria, determine the optimal conditions of temperature, pH, concentration and type of carbon and nitrogen sources on the level of PHA synthesis and the use of waste oil as a cheap substrate of carbon for the synthesis of PHA by isolated bacteria. Materials and methods: At first 9 samples of soil contaminated with crude oil, from 9 points at 4 well sites in Masjed-Soleiman oil field were taken. The initial screening was done by MSM at the temperature of 28 C. Isolates from the view point of producing PHA, were confirmed, by using Sudan black stain and were identified by using phenotypical tests and 16S rRNA sequence determination. Also, optimization of temperature, pH, carbon and nitrogen sources were made for bacteria growth. Results: In this study eleven isolates were identified as PHA producers and among them the highest range belongs to MIS-1 strain by the range of 58.522 percent of the cellular dry waight, wich produces the maximum PHA. This isolate is recognized as the species of pseudomonas aeroginosa according to the phenotypic tests and sequence analysis of 16S rRNA with 95 % similarity. In addition, the results of optimization tests showed that, the isolates in the temperature of 37 C, pH7, glucose as the source of carbon and ammonium sulphate as the source of nitrogen and finally, concentration of 10 g/lit of the carbon source and 0.5 g/lit of nitrogen source, the highest range of PHA was synthesized. Discussion and conclusion: The results of this research show that the soil polluted with crude oil of Masjed- Soleiman oil field, in long term and also due to high rate of carbon, provides a suitable environment for screening of beneficial bacteria such as PHA producing bacteria.