اثر تعداد سلولهاي گرانولوزا در محيط كشت در بيان ژن آنزيمهاي موثردر ساخت هورمونهاي استروييدي

Effect of number of culture medium granulosa cells on gene expression of enzymes associated with synthesis of steroid hormones

زمينه مطالعه: سلولهاي گرانولوزا داراي نقشي كليدي در مسير استروييدوژنسيز هستند. هدف: از مطالعه حاضر بررسي تراكم سلولهاي گرانولوزا كشت داده شده حاصل از فوليكولهاي mm 5-2بر تراوش استراديول و بيان ژنهاي مرتبط با ساخت استراديول و پروژسترون بود. روش كار: به طور خلاصه، فوليكولهاي mm 5-2 از تخمدان گاوهاي بالغ از كشتارگاه جمع آوري شدند، پس از جدا سازي و شمارش سلولها با استفاده از رنگ تريپان بلو 4/0%، سلولهاي گرانولوزا در محيط DMEM/F12 به مدت شش روز كشت داده شدند. تيمارها شامل 1) 500 هزار سلول در mL500 محيط كشت، 2) 500 هزار سلول در mL 200 محيط كشت، 3) 250 هزار سلول در mL500 محيط كشت و 4) 250 هزار سلول در mL200 محيط كشت بود. دادههاي مربوط به بيان ژنها با استفاده از نرم افزار JMP مورد تجزيه و تحليل قرار گرفتند. نتايج: در شرايطي كه مقدار محيط كشت ثابت بود كاهش تعداد سلولها (كاهش تراكم) منجر به افزايش غلظت استراديول گرديد و در شرايطي كه تعداد سلولها ثابت بود كاهش محيط كشت (افزايش تراكم) سبب كاهش غلظت استراديول گرديد. ميزان پروتيين و RNA استخراجي تفاوتي بين تيمارها نداشت. با كاهش تراكم بيان ژنهاي FSHR، CYP19، 17BHSD افزايش و بيان ژنهاي GADD45B و StAR كاهش يافت. نتايج مطالعه حاضر نشان داد كاهش تراكم سلول سبب افزايش توليد استراديول و همچنين افزايش mRNA كد كننده آنزيمهاي استروژنيك گرديد ولي بالعكس سبب كاهش بيان mRNA كد كننده آنزيمهاي پروژستژنيك (Progestagenic) گرديد. نتيجهگيرينهايي: غلظت پروتيين با كاهش تراكم سلول تغيير نكرد در نتيجه ميتوان سلول را از اثرات مضر افزايش تراكم محافظت كرد.

BACKGROUND: Granuloca cells have a key role during estroeidogenesis. OBJECTIVES: The purpose of this study was to determine the effect of number of culture medium granulosa cells on estradiol concentrations and mRNA codding estrogenic and progestagenic enzyme. METHODS: Briefly, follicles between 2 and 5 mm diameter were dissected from the ovaries of adult cows and were collected by rinsing the follicle walls with Dulbecco Modified Eagle medium/F12 (DMEM/F12). The number of cells was counted with a haemocytometer and the viable cells were assessed by the dye exclusion method using 0.4% Trypan Blue. Treatments were 1) 500,000 cell/500 ml, 2) 250,000 cell/500 ml, 3) 500,000 cell/200 ml 4) 250,000 cell/ 200 ml. All data were analyzed by JMP (SAS). RESULTS: Low plating density increased E2 secretion and mRNA encoding LHR, FSHR and estrogenic enzymes (17BHSD, CYP19), whereas decreased mRNA encoding GADD45B. There were no differences among treatments for RNA and protein concentration. Low plating density also decreased protein amount but there was no difference among treatments for RNA amount. In conclusion, decreased cell density cause increase in mRNA encoding codding estrogenic enzyme gene expression and decrease in mRNA encoding progestagenic enzyme gene expression. CONCLUSIONS: Protein concentrations did not changed with decreased cell density therefore we can save cells against harmful effect of increasing cell density.