ساخت سازه چندمنظوره كلروپلاستي براي ايجاد گياهان تراريخته توليدكننده بيوپليمر زيست‌تخريب‌پذير و مقاوم به شوري، خشكي و سرما

Construction of a Multifunctional Chloroplast Vector to Make Transgenic Plants Producing Biodegradable Biopolymer and Resistant to Salt, Drought and Cold Stresses

هدف از تحقيق حاضر طراحي و ساخت ناقلين اختصاصي انتقال و بيان كلروپلاستي ژن‌هاي توليد كننده بيوپليمر و ايجاد تحمل به تنش‌هاي غيرزنده بود. بدين‌منظور سه ژن درگير در مسير بيوسنتزي پلي‌هيدروكسي بوتيرات جداسازي شد و صحت جداسازي و عملكردي بودن ژن‌ها پس از بيان در وكتور بياني و توليد باكتري نوتركيب توليدكننده‌ي PHB اثبات گرديد. سپس يك كاست بياني القايي براي اين گروه ژني تحت پيشبر groE و پايانبر Thr طراحي و در راستاي نشانگر neo ادغام شده با زيرواحد بزرگ atpB تحت پيشبر و پايانبر كلروپلاستي psbA و بين توالي‌هاي loxP همسانه‌سازي شد. كاست حاصل در مركز توالي هدف‌گيري‌كننده كلروپلاستي چهاركيلوبازي كه از ژنوم پلاستيدي جهت ايجاد امكان الحاق كاست‌ها به داخل ناحيه بين ژني trnI/trnA ژنوم كلروپلاستي از طريق نوتركيبي همولوگ جداسازي شده بود، همسانه‌سازي گرديد و دو ناقل پلاسميدي نوتركيب تحت عنوان pFNPi(+) و pFNPi(-) ساخته شد. علاوه‌بر اين ژن badh كه با رفع سميّت از بتايين آلدهيد علاوه­بر ايجاد مقاومت به شوري، خشكي، سرما به‌عنوان نشانگر غيرآنتي­بيوتيكي نيز قابل استفاده است، پس از حذف اينترون‌ها، بهينه‌سازي كدوني، حذف جايگاه‌هاي شناسايي آنزيم‌هاي اندونوكلياز داخلي كه تحت پيشبر Prrn كلروپلاستي و 5’UTR T7gene10 قرار داده شده بود به وكتور كلروپلاستي مذكور اضافه گرديد. سازه حاصل تحت عنوان pFBNPi مناسب براي انتقال ژن به باكتري و ژنوم پلاستيدي گياه بوده و جهت ايجاد گياهان مقاوم به شوري، خشكي، سرما و توليدكننده‌ي بيوپليمر زيست‌تخريب‌پذير PHB مورد استفاده قرار خواهد گرفت.

The objective of the present study was to design and construction of a specific chloroplast vector to produce biodegradable biopolymers and also induce abiotic tolerance in transgenic plants. To do this, three genes involved in Polyhidroxybutirate biosynthetic pathway were isolated. The genes isolation and functionality accuracy was proved using expression in recombinant E. coli. Then an inducible expression cassette was designed for this operon under control of groE promoter and Thr terminator and subsequently cloned adjacent of neo selectable marker gene integrated with large subunit of atpB under control of psbA promoter and terminator among loxP sequences. The resulting cassette was cloned in the center of a 4Kb fragment from chloroplast genome that makes possibility of transgene targeting into trnI/trnAintergenic region by homologous recombination. These recombinant plastid vectors were called pFNPi(+) and pFNPi(-). Moreover badh gene was added to the chloroplast vector. This gene coding a protein detoxifing Betaine could be used for resistance to salt, drought and cold stresses. After intron removing, codon optimization and remove of internal restriction enzyme recognition sites was placed under Prrn promoter and T7gene10 5’UTR. The final resulting vector called pFBNPi will be suitable for bacteria and plant transformation for production of biodegradable biopolymer and resistant transplastomic plant for salt, drought and cold stresses.