خالص سازي توكسين اپسيلون از سويه واكسينال كلستريديوم پرفرنژنس تيپ D با استفاده از كروماتوگرافي تبادل يون و ژل فيلتراسيون

Purification of epsilon toxin from vaccinal strain of clostridium perfringens type D using ion exchange chromatography and gel filtration

باكتري كلستريديوم پرفرنژنس تيپ D در بره ها، گوساله ها، كره اسب ها، بچه خوك ها و جوجه ها باعث ايجاد بيماري انتروتوكسمي يا pulpy kidney مي‌شود. همچنين در انسان، عامل بيماري enteritis necroticans مي‌باشد. مهمترين توكسين تيپ D توكسين اپسيلون است. اين توكسين به عنوان مهمترين فاكتور ويرولانس باكتري كلستريديوم پر فرنژنس تيپ D در بيماري زايي به شمار ميرود. در مطالعه حاضر، عمليات خالص سازي توكسين اپسيلون با استفاده از تكنيك هاي مختلف كروماتوگرافي نظير كروماتوگرافي تعويض كاتيون CM-Sepharose و ژل فيلتراسيون Sephadex-G100 با هدف ابداع روشي جديد و اقتصادي به منظور خالص سازي توكسين اپسيلون انجام شد. پس از كشت باكتريايي، MLD نمونه حاصل از كشت باعث مرگ موشها تا رقت 8000/1 گرديد. همچنين نمونه كشت اوليه باعث مرگ سلولهاي MDCK در كشت سلولي شد. بهترين غلظت نمك سولفات آمونيوم جهت ترسيب و تغليظ نمونه كشت باكتريايي 60 درصد تعيين شد. پس از عمليات ترسيب، تغليظ و دياليز، نمونه خام روي كروماتوگرافي تعويض كاتيون CM-Sepharose بارگذاري شد. توكسين اپسيلون در غلظت نمك 100 ميلي مولار خارج گرديد. توكسين اپسيلون بر اساس فعاليت توكسين در مراحل مختلف خالص سازي حدود 9/138 برابر خالص شد. وزن مولكولي اين توكسين حدود 34 كيلو دالتون تعيين گرديد. با توجه به يافته هاي اين تحقيق، روش هاي استفاده شده در عمليات خالص سازي اين توكسين مناسب مي‌باشد و توكسين به دست آمده داراي ميزان فعاليت و درجه خلوص مناسبي است.

Clostridium perfringens type ِD strains cause severe enteroxemia in sheep, calves, goats, pigs and chickens. epsilon-toxin is introduced to be the essential virulence factor of this microorganism. In the present study, a new method was established for the purification of epsilon toxin from culture supernatant fluid of Clostridium perfringens type D vaccinal strain. The three steps of the purification scheme involved ammonium sulfate precipitation, cation exchange chromatography (CM- Sepharose) and gel filtration (Sephadex G-100). epsilon toxin was purified about 138.9-fold from the Sephadex G-100 column in terms of the toxin lethality. The molecular weight of the epsilon toxin determined by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis was approximately 34kD. MDCK exposed to epsilon toxin showed a cell border retraction, cytoplasmic blebbing, cell shrinkage and cell rounding. In conclusion, this new method for purification of epsilon toxin of clostridium perfringens type D is reliable and the purified epsilon toxin has high activity.