كلونينگ و توليد نوتركيب آنزيم گرانزيم M انساني

Cloning and Production of Recombinant Human Granzyme M Enzyme

زمينه و هدف: گرانزيم M يكي از اعضاي خانواده‌ي سرين پروتيازهاست كه درلنفوسيت‌هاي T سيتوتوكسيك و سلول‌هاي NK بيان مي‌شود. گرانزيم M يك القاكننده‌ي آپوپتوز در سلول‌هاي توموري هدف مي‌باشد. بنابراين با توجه به اهميت گرانزيم M در آپوپتوز، هدف از اين تحقيق توليد آنزيم فعال به لحاظ زيستي است. روش بررسي: قطعهcDNA مربوط به گرانزيم M فعال به درون ناقل بياني pET21a(+) كلون و ناقل نوتركيب جهت بيان پروتيين، به سلول‌هاي مستعد با روش شوك حرارتي منتقل گرديد. جهت بيان بالاي پروتيين، شرايط القا بهينه گرديد و سپس آناليز پروتيين توسط SDS-PAGE انجام گرفت. سپس انكلوژن‌بادي‌هاي توليدي در بافر حاوي اوره 8 مولار حل شده و با استفاده از كروماتوگرافي تمايلي نيكل-آگارز خالص شد. فعاليت پروتيازي گرانزيم M با استفاده از سوبستراي كازيين و با روش اسپكتروفتومتري (طيف سنجي) سنجيده شد. يافته‌ها: گرانزيم M نوتركيب در باكتري E.coli به‌صورت انكلوژن‌بادي توليد شد و بهترين سطح بيان در دماي 22 درجه‌ي با غلظت 1 ميلي‌مولار از IPTG در طول 5 ساعت بود. با استفاده از ستون نيكل- آگارز و شيب غلظت اوره، گرانزيم M به‌طور همزمان با تاخوردن، خالص گرديد. نتايج حاصل از تعيين فعاليت نشان داد كه آنزيم در حضور سوبستراي كازيين فعال بوده و فعاليت ويژه‌اش 71 واحد بر ميلي‌گرم است. فعال بودن گرانزيم M نشان دهنده‌ي اين بود كه آنزيم تاخوردگي درستي پيدا كرده است. نتيجه‌گيري: با توجه با اينكه گرانزيم M مي‌تواند هدفي بالقوه براي داروهاي ضد سرطان باشد، بنابراين روش پيشنهادي در اين تحقيق مي‌تواند تسهيل كننده مطالعه بيشتر بر روي اين آنزيم باشد. واژگان كليدي: گرانزيمM، آپوپتوز، كازيين، فعاليت پروتيازي، انكلوژن‌بادي

Background and Objective: Granzyme M is a member of a granule serine proteases family, which is mainly expressed by cytotoxic T lymphocytes and natural killer cells. Granzyme M appears to be a potent inducer of tumor cell apoptosis. With respect to the importance of Granzyme M in the apoptosis, the aim of this work is the production of the biologically active enzyme. Materials and Methods: The cDNA fragment of active hGzm M, was cloned into bacterial expression vector pET21a (+). Recombinant plasmid was transformed into competent cells via heat shock method for protein expression. Induction condition was optimized to obtain high yield of recombinant protein and then protein expression analysis was done by SDS-PAGE. Produced inclusion bodies were dissolved in buffer solution containing Urea (8M) and then purified by Ni-Agarose Affinity Chromatography. The protease activity of granzyme M was assayed by spectrophotometric method, using casein as substrate. Results: Recombinant granzyme M was expressed as inclusion bodies in E. coli and expression of protein at 22°c with 1Mm IPTG during 5 hours provided the best protein expression level. Granzyme M was purified and refolded simultaneously by Ni-Agarose Affinity Chromatography using a concentration gradient of Urea. Results of the enzyme activity determination showed that the enzyme is active in the presence of casein and its specific activity is 71 U/mg. The activity of granzyme M showed that the enzyme was refolded properly. Conclusion: In this study a simple method was suggested to produce granzyme M and to determine the enzymatic activity of this enzyme which is involved in cancer cell apoptosis. This enzyme could be a potential target for anticancer drugs and the proposed method in this work facilitates studies on granzyme M. Key words: Granzyme M, Apoptosis, Casein, Protease activity, Inclusion bodies