استاندارد كردن PCR تشخيصي به‏ وسيله اينترنال كنترل تكثيري

Evaluation of deoxynivalenol production in dsRNA Carrying and Cured Fusarium graminearum isolates by AYT1 expressing transformed tobacco

مقدمه: بروز نتایج متفاوت در آزمایشگاه‏ها به علت استاندارد نبودن، از معایب روش‏‏‏‏های تكثیر مولكولی است. در بیشتر مقالات چاپ شده در زمینه تشخیص PCR عوامل عفونی، ‏اینترنال كنترل تكثیری (IC) وجود ندارد. هدف از پژوهش حاضر، طراحی و توسعه یك روش ساده و سریع، برای‏‏‏‏‏‏ ساخت اینترنال كنترل آزمون‏‏ PCR ‏در آزمایشگاه‏های ‏تشخیصی است. ‏ مواد و روش‏‏ها: در پژوهش حاضر، برای ساخت اینترنال كنترل رقابتی، از پرایمرهای مركب و روش PCR-Cloning استفاده شد‏‏. بدین ترتیب كه پرایمرهای جلویی و عقبی تشخیص PCR ویروس هپاتیت) ‏(HBV، ویروس هرپس سیمپلكس ‏HSV))، مایكوباكتریوم توبركلوزیس (MTB)،‏‏ مایكوپلاسما پنومونیه (Mpn)،‏‏ كریپتوكوكوس نئوفورمنس ‏(Cne)،‏‏ جنس سالمونلا (Sal. sp) و جنس مایكوپلاسما (M. sp) را در بخش '5 پرایمرهای ژن كینتوپلاست لیشمانیا، به شكل‏‏ دم طراحی و سنتز شد. اینترنال كنترل‏های تكثیری با پلاسمید pTZ57R الحاق و در باكتری اشریشیاكلی JM107 ترانسفورم شد‏‏. تعداد حداقل IC در هر واكنش PCR از طریق رقیق‏سازی ‏‏‏‏و همین‏طور طیف پاسخ PCR همراه با IC بررسی شد‏‏‏‏‏‏‏‏‏. ‏ نتایج: HBV–HSV–MTB–MPN–Cne–Sal. sp– و M. sp با پرایمر‏های اختصاصی به ترتیب برابر با 272bp-284bp-415bp-345bp-245bp-454bp-262bp و محصول اینترنال كنترل هم به ترتیب 672bp-668bp-661bp-669bp-660bp-662bp-660bp جفت باز بود، كه از نظر اندازه، اختلاف مطلوبی بین محصول PCR و IC وجود دارد و به آسانی در ژل قابل تفكیك است. تعداد حداقل IC در هر واكنش، 1000 عدد تعیین شد. حداقل و حداكثر حساسیت آزمون‏‏ PCR همراه با IC برای همه عوامل در حد مطلوبی به دست آمد. در آزمون‏‏ ویژگی با عوامل مختلف هم، هیچ محصول ناخواسته‏ای ‏مشاهده نشد. ‏ بحث و نتیجه‏گیری: نتایج منفی و مثبت كاذب كه به علت‏های‏‏‏ مختلف در روش‏‏‏ PCR رخ می‏دهد از مشكلات مهم این روش‏‏‏ جذاب است‏‏‏. استفاده از یك اینترنال كنترل در تشخیص مولكولی به عنوان كنترل داخلی، می‏‏تواند این خطاها را شناسایی كند. ‏

Introduction: Fusarium head blight (FHB), is the most destructive disease of wheat, producing the mycotoxin deoxynivalenol, a protein synthesis inhibitor, which is harmful to humans and livestock. dsRNAmycoviruses-infected-isolates of Fusariumgraminearum, showed changes in morphological and pathogenicity phenotypes including reduced virulence towards wheat and decreased production of trichothecene mycotoxin (deoxynivalenol: DON). Materials and methods: Previous studies indicated that over expression of yeast acetyl transferase gene (ScAYT1) encoding a 3-O trichothecene acetyl transferase that converts deoxynivalenol to a less toxic acetylated form, leads to suppression of the deoxynivalenol sensitivity in pdr5 yeast mutants. To identify whether ScAYT1 over-expression in transgenic tobacco plants can deal with mycotoxin (deoxynivalenol) in fungal extract and studying the effect of dsRNA contamination on detoxification and resistance level, we have treated T1 AYT1 transgenic tobacco seedlings with complete extraction of normal F. graminearum isolate carrying dsRNA metabolites. First, we introduced AYT1into the model tobacco plants through Agrobacterium-mediated transformation in an attempt to detoxify deoxynivalenol. Results: In vitro tests with extraction of dsRNA carrying and cured isolates of F. graminearum and 10 ppm of deoxynivalenol indicated variable resistance levels in transgenic plants. Discussion and conclusion: The results of this study indicate that the transgene expression AYT1 and Fusarium infection to dsRNA can induce tolerance to deoxynivalenol, followed by increased resistance to Fusarium head blight disease of wheat.