جداسازي و غربال‏گري باكتري بومي سيتروباكتر‏‏ با تحمل‏پذيري بالا به نيكوتين و معرفي آن به عنوان بيوكاتاليست براي پاك‏سازي زيستي نيكوتين

Isolation and Screening of a native Citrobacter sp. with high nicotine-tolerant and its application as a biocatalyst for biodegradation of nicotine

مقدمه: نیكوتین از آلكالوئیدهای گیاهی سمی است كه سازمان حفاظت محیط زیست آمریكا آن را از سال 1994در زمره مواد خطرناك برای سلامت انسان و محیط زیست قرار داده است. پژوهش حاضر، در زمینه غربال‏گری باكتری‏های مقاوم به نیكوتین برای استفاده به عنوان بیوكاتالیست در پاك‏سازی نیكوتین از مكان‏های آلوده انجام شده است. ‏‏‏ مواد و روش‏‏ها: نمونه‏های خاك جمع‏آوری شده از 12 مزرعه زیر كشت توتون به عنوان محل‏های هدف برای نمونه‏گیری انتخاب شد. غنی‏سازی جدایه‏های باكتری تجزیه كننده نیكوتین در محیط‏های پایه نمكی حاوی نیكوتین به عنوان تنها منبع كربن و ازت انجام شد. آزمون الگوی تحمل‏پذیری ذاتی جدایه‏ها به نیكوتین با استفاده از روش رقت در آگار انجام شد. تعیین هویت سویه منتخب بر اساس آزمون‏های فنوتیپیك و فیلوژنیك انجام شد. به منظور تعیین شرایط مطلوب حذف نیكوتین در سویه منتخب، اثر غلظت نخستین نیكوتین، زمان گرماگذاری و اثر منابع كربن و ازت كمكی بررسی شد. اندازه‏گیری میزان نیكوتین باقی مانده با استفاده از كروماتوگرافی مایع با عملكرد بالا (HPLC) انجام شد. ‏‏‏ نتایج: از مجموع 20 سویه جداشده تجزیه كننده نیكوتین، سویه باكتری TPS2 بالاترین مقاومت و حذف نیكوتین را نشان داد. نتایج آزمون‏های فنوتیپیك و فیلوژنیك نشان داد كه سویه یاد شده به جنس سیتروباكتر‏‏ (با كد شناسایی KM110046 در بانك ژن) تعلق دارد. بر اساس نتایج به دست آمده از آزماش‏های نیكوتین‏زدایی در سویه TPS2، پس از گذشت 60 ساعت كمابیش 100 درصد نیكوتین حذف شد. البته در شرایطی كه 5/2 گرم در لیتر نیكوتین همراه با 5/2 گرم در لیتر قند فروكتوز استفاده شد. ‏‏‏ بحث و نتیجه‏گیری: نتایج نشان داد كه باكتری سیتروباكتر‏‏ غربال‏گری شده گزینه مناسبی برای پاك‏سازی زیستی نیكوتین از پساب صنایع و مكان‏های ‏‏آلوده است‏. انتظار می‏رود كه با استفاده از این بیوكاتالیست میكروبی بتوان مشكلات زیست محیطی ناشی از نیكوتین سمی را كاهش داد. مطالعه اخیر نخستین گزارش از معرفی یك میكروارگانیسم بومی تجزیه كننده نیكوتین است. ‏‏‏

Introduction: Nicotine is a toxic plant alkaloid and it has been designated as hazardous by the United States Environmental Protection Agency (USEPA) since 1994. The present work was directed to screen nicotine resistant bacteria, that is used as biocatalyst in the biodegradation of nicotine from contaminated sites. Materials and methods: Collected soil samples from 12 tobacco farms were selected as target sites for sampling. Enrichment nicotine-degrading bacteria were performed in minimal salt media containing nicotine as the sole carbon and nitrogen sources. Agar dilution plate method was performed for determining intrinsic tolerance of bacterial isolates to nicotine. Phenotypic characterization and phylogenetic analysis were used to identify the selected bacterial isolate able to degrade nicotine. To determine the optimal conditions for the bio-removal of nicotine, the effects of initial nicotine concentration, incubation time and the addition of carbon and nitrogen sources in the selected strain were tested. The quantification of residual nicotine in the culture media was measured by high performance liquid chromatography (HPLC). Results: Among 20 bacterial isolates for degradation of nicotine, the strain TPS2 showed a high level of resistance and degradation efficiency. Results of phenotypic identification and phylogenetic analysis showed the native strain TPS2 belongs to the Citrobacter sp. strain TPS2 (GeneBank accession no. KM110046). According to the results of de-nicotination experiment, the native strain TPS2 is able to remove 100% of nicotine with an initial concentration 2.5 g/l in the presence of 2.5 g/l fructose. Discussion and conclusion: The results showed that the screened Citrobacter sp. was suitable candidate for degradation of nicotine from wastewater and sites that contaminated with nicotine. It is seemed by using of the microbial biocatalyst the ecosystem contamination of toxic nicotine can be decreased. The present work is the first report on the degradation of nicotine by native microorganisms.