كلونينگ ژن هورمون رشد (GH) فيل ماهي (Huso huso) در سازه هاي لنتي ويروسي و غير ويروسي و بررسي بيان ژن در سلولهاي بنيادي جنيني انساني

كلونينگ ژن هورمون رشد (GH) فيل ماهي (Huso huso) در سازه هاي لنتي ويروسي و غير ويروسي و بررسي بيان ژن در سلولهاي بنيادي جنيني انساني

يكي از مهمترين كاربردهاي مهندسي ژنتيك در تحقيقات آبزي پروري، افزايش ميزان رشد ماهيان پرورشي از طريق انتقال ترنس ژن هاي هورمون رشد به آنهاست. اما پيش از هر گونه تلاش در جهت انتقال ژن، ساخت و سنتز اين ترنس ژن هاي مطلوب الزامي است. از اين رو هدف از اين تحقيق، ساخت لنتي ويروس هاي نوتركيب حاوي ژن و بهره گيري از آنها براي انتقال سازه ژني به سلول هاي هدف، به منظور Huso huso فيل ماهي (GH) هورمون رشد هورمون رشد فيل ماهي كه با cDNA ، توليد پروتيين نوتركيب هورمون رشد و آناليزهاي بياني است. در اين مطالعه تكثير شده و سپس اين قطعه PCR استخراج شده از غده هيپوفيز سنتز شده بود، توسط تكنيك RNA استفاده از بر اساس جايگاه هاي آنزيمي مشخص برش داده شده و نهايتاً pTZ57R/T ژن پس از كلونينگ در وكتور پلاسميدي پيوند و ساب كلون گرديد. بدين گونه اين سازه قادر به pNL-EGFP/CMV-WPRE به بدنه ناقل لنتي ويروسي توليد تيترهاي بالايي از ويروس هاي نوتركيب بالغ و فعال است. طي ترانسفكشن همزمان ناقل نهايي )ناقل انتقال و ناقل غشايي pCD/NL- BH*??? به همراه دو ناقل كمكي )ناقل بسته بندي ويروس )pLV-GH-IRES-EGFP لنتي ويروس هاي نوتركيب حاوي سازه ،HEK-293T با ليپوفكتامين به درون رده سلولي جنيني انساني )LTR-G بواسطه ،EGFP تاييد شدند. از آنجاكه در ساختار اين وكتور ژن نشانگر RT-PCR ژني مورد نظر توليد و با تكنيك قرار داده شده است، بيان ژن در مراحل ترانسفكشن و ترانسداكشن به سهولت GH در فرودست ژن IRES قطعه تحت نور فلورسنت پيگيري شد. با تيتراسيون اين لنتي ويروس هاي نوتركيب در اين رده سلولي و تغليظ سوپرناتانت استوك غليظي از ويروس هاي نوتركيب بدست آمد، كه در حدود ،Amicon ويروسي با ستون هاي تخليص پروتيين )يك پنجم كل استوك( توانست در مرحله ترانسداكشن )آلوده سازي سلول هاي هدف با ويروس حامل ژن( تيترهاي فيل ماهي را توليد نمايد. نهايتاً بيان پايدار پروتيين GH بالايي از ويروس هاي نوتركيب بالغ و فعال حامل ژن تحت ميكروسكوپ فلورسنت در اين سلول ها آشكار شده و EGFP هورمون رشد فيل ماهي به همراه پروتيين نشانگر محرز گرديد. نتايج اين تحقيق بيانگر اين است كه از لحاظ mRNA در سطح RT-PCR اثبات بيان توسط آناليز ارزيابي روش انتقال ژن بواسطه ناقلين لنتي ويروسي، اين تكنيك از كارآيي بسيار بالايي برخوردار است و در جهت بستر سازي در عرصه تخليص و انبوه سازي هورمون رشد نوتركيب فيل ماهي بعنوان دارو و نيز از ديدگاه مولكولي به ماهيان و ديگر آبزيان و توليد گونه هاي ترنس ژنيك، اين مطالعه توانسته است راه GH در جداسازي و انتقال ژن گشا باشد.

Caviar-producing fish with their economically valuable product are important in fisheries. The cDNA growth hormone (GH) of Beluga sturgeon (Huso huso) was constructed using total RNA from pituitary glands. To construct the recombinant and active lentiviruses carring GH gene, this DNA sequence was inserted into the cloning vector pTZ57R/T and subsequently cutted from pTZ57R/T by endonuclease enzyme and incorporated into lentivirus vector pNL-EGFP/CMV-WPRE on upstream of an IRES cassette. We also insert a reporter EGFP gene downstream of IRES so transfection and transduction steps can be traced. Using this vector plus virus packaging and envelope vectors, HEK-293T cells was co-transfected by DNA-Lipofectamine complexes method. Cell supernatant full of virions was collected 48 hours later and concentrated using Amicon columns to obtain a high-titer virus stock. Nearly 1/5 of this stock was applied to a new batch of cultured HEK-293T. After 72h expression of EGFP gene was detected and the cells was collected for further analysis. Total RNA of these transduced cells was extracted and GH mRNA expression was revealed by RT-PCR. Results showed that, lentiviral vectors (LV) as a gene transfer system provide efficient delivery, integration and long-term expression by establishing a stable provirus in target cells and could be important tool in aquaculture and fisheries biotechnology research to increase the growth rate of farmed fish by transferring growth hormone (GH) transgenes into fish.