ساخت لنتي‏ويروس‏هاي نوتركيب ناقل ژن DJ-1 و انتقال آن‏ها به سلول‏هاي انساني

Production of Carrying DJ-1 Gene Recombinant Lentiviruses and Their Transition to Human Cells

هدف: اهداف اين مطالعه ساب‏كلونينگ ژن (PARK7) DJ-1 به‏ درون وكتور انتقال لنتي‏ويروسي، توليد لنتي‏ويروس‏هاي نوتركيب و آلوده سازي سلول‏هاي هدف با اين ويروس‏ها مي‏باشند. مواد وروش‏ها: ژن DJ1 با استفاده از آنزيم هاي محدود كننده EcoR1 و Xho1 از وكتور pcDNA-DJ1 به دست آمد. وكتور انتقالي لنتي ويروس به صورت همزمان توسط آنزيم هاي محدود كننده EcoR1 و Sal1 بريده شد. ژن DJ1 توسط آنزيم DNA ليگاز T4 به داخل وكتور ترانسفر و بالادست ژن DJ1 وارد شد، به طوريكه توالي DJ1-IRES-Jred در پايين دست و تحت كنترل پروموتر CMV قرار گرفت. براي توليد لنتي ويروس هاي نوتركيب، وكتور ساخته شده به همراه دو وكتور بسته بندي و پوشش ويروس به طور همزمان به درون سلول هاي HEK (Human Embryonic Kidney) انتقال داده شدند. ويروس هاي ساخته شده براي آلوده سازي سلول هاي هدف استفاده شدند. نتايج: براي اطمينان از درستي ساب‏كلونينگ از تست‏هاي آنزيمي و PCR استفاده شد. همچنين براي مشاهده بيان ژن Jred كه نشان دهنده موفقيت ما در انتقال ژن مي باشد، از ميكروسكوپ فلورسانس استفاده شد. سپس براي مشاهده افزايش بيان ژن DJ1 در سلول هاي آلوده شده نسبت به سلول هاي طبيعي، از تست RT-PCR استفاده شد. نتيجه گيري: اين مطالعه كاربرد موفقيت آميز ناقل‏هاي لنتي‏ويروسي در انتقال ژن به سلول‏هاي يوكاريوتي را نشان مي‏دهد و روشن مي‏سازد كه اين ناقل‏ها مي‏توانند در درمان بيماري‏هاي سيستم عصبي مورد استفاده قرار گيرند.

Aim: The aims of this study were subcloning of Dj-1(PARK7) gene to lentiviral transfer vector, recombinant lentiviruses production and target cells infection with these viruses. Material and methods: DJ1 gene obtained from pcDNA-DJ1 vector using restriction enzymes EcoR1 and Xho1. Lentiviral transfer vector was coincidental digested using EcoR1 and Sall enzymes. DJ-1 gene was interred into the lentiviral transfer and upstream of Jred gene using T4-DNA ligase. As DJ1-IRES-Jred sequence was placed in downstream and control of CMV promoter. To production of recombinant lentivruses, the made vector is coincidental transferred into the HEK-293T (Human Embryonic Kidney) cells with two packaging and envelope lentiviral vectors. Produced virus was used for target cells infection. Results: For integrity of subcloning, enzymatic tests and PCR were used. Fluorescent microscopy also used to show expression of Jred reporter gene that showed the success of our gene transferring .Then RT-PCR was done for showing overexpression of DJ1 gene in transduced cells compare with normal cells. Conclusion: This study show the lentiviral vectors success in gene transferring to eukaryotic cells and clear that this vectors can be used in treatment of nervous system diseases. Keywords: Cloning, DJ1, lentivirus